विश्लेषी व अभिकलनात्मक उपकरण — सूक्ष्मदर्शिकी, स्पेक्ट्रमिकी, परख, जैवसूचना-विज्ञान व तंत्र जीवविज्ञान

खंड 6 का दूसरा अध्याय अंतिम दो उपशीर्षक लेता है: विश्लेषी उपकरण व अभिकलनात्मक उपकरण। विश्लेषी उपकरण वे यंत्र हैं जो हमें अणु देखने व मापने देते हैं: सूक्ष्मदर्शिकी के सिद्धांत (प्रकाश, इलेक्ट्रॉन, प्रतिदीप्ति व कॉन्फ़ोकल), स्पेक्ट्रमिकी के सिद्धांत (UV, दृश्य, प्रतिदीप्ति, वृत्तीय द्विवर्णता, IR व FT-IR, द्रव्यमान स्पेक्ट्रमिकी व NMR), वैद्युतकण-संचलन, सूक्ष्मसरणी, एंज़ाइमी परख, प्रतिरक्षापरख (ELISA, RIA, प्रतिरक्षाऊतकरसायन), प्रतिरक्षाब्लॉटिंग, प्रवाह कोशिकामिति, तथा समस्त-जीनोम व ChIP अनुक्रमण। अभिकलनात्मक उपकरण जैवसूचना-विज्ञान हैं: संसाधन व खोज उपकरण, अनुक्रम व संरचना डेटाबेस, अनुक्रम विश्लेषण — फ़ाइल प्रारूप, स्कोरिंग आव्यूह, संरेखण व जातिवृत्त — जीनोमिकी, प्रोटीनोमिकी व उपापचयोमिकी, जीन पूर्वानुमान, कार्यात्मक टिप्पणीकरण, द्वितीयक- व त्रिविम-संरचना पूर्वानुमान, जैवरासायनिक डेटाबेसों में ज्ञान खोज, मेटाजीनोमिकी, तथा उपापचयी अभियांत्रिकी व तंत्र जीवविज्ञान।

1. सूक्ष्मदर्शिकी के सिद्धांत — प्रकाश, इलेक्ट्रॉन, प्रतिदीप्ति व कॉन्फ़ोकल

किसी सूक्ष्मदर्शी को विभेदन से आँका जाता है — दो बिंदुओं के बीच वह न्यूनतम दूरी जो अब भी अलग दिखे — जो ऐबे सीमा, d = lambda/(2·NA) से निर्धारित होती है, जहाँ lambda तरंगदैर्घ्य और NA = n·sin(theta) संख्यात्मक द्वारक है। छोटा तरंगदैर्घ्य व बड़ा NA महीन विभेदन देते हैं। दृश्य प्रकाश (~550 nm) प्रयोग करने वाला प्रकाश सूक्ष्मदर्शी लगभग 200 nm तक विभेदित करता है, इसीलिए वह अधिकांश आणविक विवरण नहीं देख सकता। विपर्यास विधियाँ — उज्ज्वल क्षेत्र, अरंजित जीवित कोशिकाओं हेतु प्रावस्था विपर्यास व विभेदी व्यतिकरण विपर्यास (DIC), तथा श्याम क्षेत्र — बदलती हैं कि विपर्यास कैसे बनता है, विभेदन नहीं। इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी इलेक्ट्रॉन प्रयुक्त करता है, जिनका तरंगदैर्घ्य हज़ारों गुना छोटा है, अतः वह नैनोमीटर या उससे नीचे तक विभेदित करता है: TEM (पारगमन) इलेक्ट्रॉनों को अति-पतले काटों से गुज़ारकर आंतरिक संरचना देता है, जबकि SEM (क्रमवीक्षण) किसी सतह का क्रमवीक्षण कर उसका त्रिविम-सा प्रतिबिंब देता है।

प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शिकी किसी प्रतिदीप्तिकारी को एक तरंगदैर्घ्य पर उत्तेजित करती है और वह जो दीर्घ-तरंगदैर्घ्य प्रकाश उत्सर्जित करता है (स्टोक्स विस्थापन) उसे एकत्र करती है, अतः किसी प्रतिदीप्त प्रतिरक्षी या GFP संलयन से टैग किया एक विशिष्ट अणु श्याम पृष्ठभूमि पर चमकता है — प्रतिरक्षाप्रतिदीप्ति व जीवित-कोशिका प्रतिबिंबन का आधार। पर एक विस्तृत-क्षेत्र प्रतिदीप्ति प्रतिबिंब तल के ऊपर-नीचे से आए अनभिकेंद्रित प्रकाश से धुंधला होता है। एक कॉन्फ़ोकल सूक्ष्मदर्शी इसे एक छिद्र से ठीक करता है जो अनभिकेंद्रित प्रकाश अस्वीकृत करता है, अतः केवल एक पतला प्रकाशीय काट प्रतिबिंबित होता है; किरण को x–y में क्रमवीक्षण कर z में बढ़ाना एक तीक्ष्ण त्रिविम ढेर बनाता है। अतिविभेदन विधियाँ ऐबे सीमा से नीचे जाती हैं, पर कॉन्फ़ोकल प्रकाशीय कर्तन वह कार्यकर्ता है जिसे कोई GATE प्रश्न सबसे अधिक परखेगा।

🧠 इलेक्ट्रॉन प्रकाश से क्यों बेहतर
तरंगदैर्घ्य घटने पर विभेदन सुधरता है (d = lambda/2NA)। इलेक्ट्रॉनों का डी ब्रॉली तरंगदैर्घ्य दृश्य प्रकाश से हज़ारों गुना छोटा है, अतः एक इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी ऐसी संरचनाएँ विभेदित करता है जो प्रकाश सूक्ष्मदर्शी कभी नहीं। यदि कोई प्रश्न पूछे कि EM राइबोसोम क्यों देखता है और प्रकाश सूक्ष्मदर्शी नहीं, तो उत्तर तरंगदैर्घ्य है।

2. स्पेक्ट्रमिकी के सिद्धांत — UV-दृश्य, प्रतिदीप्ति, CD, IR, MS व NMR

UV–दृश्य स्पेक्ट्रमिकी किसी प्रतिदर्श द्वारा अवशोषित प्रकाश मापती है। बीयर–लैम्बर्ट नियम, A = epsilon·c·l, अवशोषकता A को सांद्रता c के समानुपाती बनाता है (epsilon मोलर अवशोषकता, l पथ लंबाई), मात्रात्मकता का आधार। न्यूक्लिक अम्ल 260 nm पर और प्रोटीन 280 nm पर (ऐरोमैटिक अवशेषों से) अवशोषित करते हैं, अतः A260/A280 अनुपात शुद्धता बताता है: स्वच्छ DNA हेतु लगभग 1.8 व स्वच्छ RNA हेतु 2.0, प्रोटीन संदूषित होने पर कम। प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रमिकी उत्सर्जित प्रकाश पढ़ती है और अवशोषकता से कहीं अधिक सुग्राही है। वृत्तीय द्विवर्णता (CD) काइरल अणुओं द्वारा वाम- व दक्षिण-वृत्तीय ध्रुवित प्रकाश के विभेदी अवशोषण को मापती है; दूर-UV में यह प्रोटीन द्वितीयक संरचना (अल्फ़ा-कुंडली, बीटा-चादर) बताती है और वलन का मानक जाँचक है।

अवरक्त (IR) व FT-IR स्पेक्ट्रमिकी आणविक कंपनों की जाँच करती हैं, अतः एक IR स्पेक्ट्रम उपस्थित क्रियात्मक समूहों का फ़िंगरप्रिंट है (किसी प्रोटीन की ऐमाइड I पट्टी उसकी द्वितीयक संरचना बताती है); FT-IR एक व्यतिकरणलेख से समस्त स्पेक्ट्रम एक साथ एकत्र करती है, जो तेज़ व अधिक सुग्राही है। द्रव्यमान स्पेक्ट्रमिकी (MS) अणुओं को आयनित कर आयनों को उनके द्रव्यमान-से-आवेश अनुपात (m/z) से अलग करती है, सटीक द्रव्यमान देते हुए; मृदु आयनन — ESI (वैद्युतफुहार) व MALDI — ने MS को प्रोटीनों व पेप्टाइडों हेतु काम का बनाया, और अनुबंधी MS (MS/MS) किसी पेप्टाइड को खंडित कर उसका अनुक्रम पढ़ती है, प्रोटीनोमिकी का हृदय। नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद (NMR) किसी प्रबल चुंबकीय क्षेत्र में नाभिकीय प्रचक्रणों (¹H, ¹³C, ¹⁵N) का व्यवहार प्रयुक्त करता है; रासायनिक विस्थापन, युग्मन व नाभिकीय ओवरहाउज़र प्रभाव परमाणु-स्तरीय संरचना व गतिकी देते हैं, और NMR विलयन में किसी प्रोटीन की त्रिविम संरचना हल कर सकता है।

हल किया उदाहरण (बीयर–लैम्बर्ट)। 1 cm क्यूवेट में एक DNA विलयन A260 = 0.30 देता है। इस परिपाटी से कि 1.0 का A260 लगभग 50 माइक्रोग्राम प्रति mL द्विरज्जुकी DNA के संगत है, सांद्रता 0.30 × 50 = 15 माइक्रोग्राम प्रति mL है। यदि यह पठन दसगुना तनुकरण से आया, तो स्टॉक 150 माइक्रोग्राम प्रति mL है। उसी प्रतिदर्श का A260/A280 अनुपात बताता है कि वह DNA प्रोटीन-मुक्त है या नहीं।

3. वैद्युतकण-संचलन, सूक्ष्मसरणी, परख, प्रतिरक्षापरख, प्रवाह कोशिकामिति व अनुक्रमण-आधारित विधियाँ

वैद्युतकण-संचलन किसी विद्युत क्षेत्र में आवेशित अणुओं को किसी जेल में अलग करता है। ऐगारोज़ जेल वैद्युतकण-संचलन न्यूक्लिक अम्लों को आकार से छाँटता है — DNA ऋणावेशित है और ऐनोड की ओर प्रवास करता है, और छोटे खंड तेज़ चलते हैं, अतः log(आकार) प्रवास दूरी में लगभग रैखिक है; इसे किसी अंतर्वेशी रंजक से देखा जाता है। SDS-PAGE प्रोटीनों को आकार से अलग करता है क्योंकि अपमार्जक SDS हर प्रोटीन को एकसमान ऋणावेश से लेपित करता है और उसे विकृत करता है, अतः प्रवास केवल द्रव्यमान पर निर्भर करता है; समविभव केंद्रण pI से अलग करता है, और द्वि-विम जेल वैद्युतकण-संचलन हज़ारों प्रोटीनों को विभेदित करने हेतु IEF फिर SDS-PAGE मिलाता है। सूक्ष्मसरणी एक जाल में हज़ारों DNA प्रोब रखती है; लेबल्ड प्रतिदर्श उनसे संकरित होता है, अतः एक DNA सूक्ष्मसरणी एक साथ हज़ारों जीनों की अभिव्यक्ति पढ़ती है (अब अधिकांशतः RNA-seq द्वारा प्रतिस्थापित) और जीनोटाइपन सरणियाँ अनेक SNP पढ़ती हैं।

प्रतिरक्षापरख किसी विशिष्ट प्रतिजन के संसूचन व मापन हेतु एक प्रतिरक्षी प्रयुक्त करती है। किसी ELISA (एंज़ाइम-युग्मित प्रतिरक्षाअधिशोषी परख) में एक प्रतिरक्षी किसी एंज़ाइम से जुड़ा होता है जो किसी अधःस्तर को किसी प्लेट रीडर में पढ़े गए रंगीन उत्पाद में बदलता है; सैंडविच ELISA उच्च विशिष्टता हेतु प्रतिजन को दो प्रतिरक्षियों के बीच पकड़ती है, और अप्रत्यक्ष ELISA किसी सीरम में प्रतिरक्षी संसूचित करती है (जैसे प्रतिरक्षी परीक्षणों में)। RIA (रेडियोप्रतिरक्षापरख) एंज़ाइम के बजाय एक रेडियोलेबल प्रयुक्त करती है और अत्यंत सुग्राही है। प्रतिरक्षाऊतकरसायन (IHC) व प्रतिरक्षाप्रतिदीप्ति किसी प्रतिजन का स्थान दिखाने हेतु ऊतक काटों पर लेबल्ड प्रतिरक्षी लगाते हैं। प्रतिरक्षाब्लॉटिंग (वेस्टर्न ब्लॉट) SDS-PAGE से अलग कर झिल्ली पर स्थानांतरित किसी प्रोटीन को संसूचित करती है। प्रवाह कोशिकामिति एकल कोशिकाओं को एक धारा में किसी लेज़र के आगे से गुज़ारती है और उनका प्रकीर्णन व प्रतिदीप्ति पढ़ती है, कोशिकाओं को सतह या आंतरिक चिह्नकों से गिनते व छाँटते हुए (FACS उन्हें भौतिक रूप से छाँटता है)। एंज़ाइमी परख किसी एंज़ाइम को उस दर से मापती है जिससे वह अधःस्तर बदलता है (पेपर का खंड 4 बलगतिकी विकसित करता है)।

अनुक्रमण-आधारित विधियाँ जीनोम व उनकी अन्योन्यक्रियाएँ सीधे पढ़ती हैं। समस्त-जीनोम अनुक्रमण किसी जीव का समग्र जीनोम पढ़ता है (NGS, अध्याय 1) और जीनोमिकी, पुनःअनुक्रमण व विभेद संसूचन का आधार है। ChIP अनुक्रमण (ChIP-seq) खोजता है कि कोई प्रोटीन समस्त जीनोम भर में DNA से कहाँ बँधता है: क्रोमैटिन को तिर्यक-बंधित किया जाता है, DNA को अपरूपित किया जाता है, प्रोटीन (एक अनुलेखन कारक या एक रूपांतरित हिस्टोन) को एक प्रतिरक्षी से खींचा जाता है (क्रोमैटिन प्रतिरक्षा-अवक्षेपण), और सह-अवक्षेपित DNA अनुक्रमित किया जाता है, अतः बंधन स्थल शिखरों के रूप में प्रकट होते हैं। यह अध्याय 1 की DNA–प्रोटीन अन्योन्यक्रिया परखों का जीनोम-व्यापी संस्करण है।

⚠️ SDS-PAGE आकार से अलग करता है, नेटिव PAGE व IEF नहीं
SDS किसी प्रोटीन के अपने आवेश को एक एकसमान ऋणावेश से ढक देता है और उसे खोल देता है, अतः प्रवास केवल द्रव्यमान पर निर्भर करता है — इसीलिए SDS-PAGE अणुभार देता है। नेटिव PAGE आकार व आवेश रखता है, और समविभव केंद्रण pI से अलग करता है, आकार से नहीं। जो प्रश्न अणुभार बताए वह SDS-PAGE का है।

4. जैवसूचना-विज्ञान — संसाधन, डेटाबेस, अनुक्रम विश्लेषण, संरेखण व जातिवृत्त

जैवसूचना-विज्ञान संसाधन व डेटाबेस। प्राथमिक अनुक्रम पुरालेख हैं GenBank (NCBI), ENA (EMBL-EBI) व DDBJ, जो परस्पर प्रतिबिंबित होते हैं; UniProt मुख्य प्रोटीन-अनुक्रम डेटाबेस है और PDB प्रायोगिक रूप से निर्धारित त्रिविम संरचनाएँ रखता है। आँकड़े मानक फ़ाइल प्रारूपों में चलते हैं — FASTA (">" से आरंभ होती एक शीर्ष पंक्ति व अनुक्रम), FASTQ (एक पाठ व प्रति-क्षार गुणता स्कोर, NGS हेतु), GenBank समतल फ़ाइलें, और संरचनाओं हेतु PDB/mmCIF। किसी अनुक्रम को किसी डेटाबेस के विरुद्ध खोजना BLAST से होता है, जो स्थानीय समानताएँ तेज़ी से खोजता है और एक E-मान बताता है — उस आकार के डेटाबेस में उस स्कोर के संयोगवश अपेक्षित हिटों की संख्या — अतः छोटा E-मान एक सार्थक, संभवतः समजात, मिलान बताता है।

अनुक्रम संरेखण समानता प्रकट करने हेतु अवशेषों को पंक्तिबद्ध करता है। एक युग्मक संरेखण वैश्विक (नीडलमैन–वुन्श, आद्यंत) या स्थानीय (स्मिथ–वॉटरमैन, सर्वोत्तम मिलान उपक्षेत्र) हो सकता है; दोनों गतिक क्रमादेशन और मिलान/असुमेलन स्कोर व अंतराल दंड की स्कोरिंग योजना प्रयुक्त करते हैं। प्रोटीनों हेतु मिलान स्कोर एक प्रतिस्थापन आव्यूह से आते हैं — PAM (निकट-संबंधी प्रोटीनों से बना व बहिर्वेशित) या BLOSUM (संरेखित अनुक्रमों के खंडों से सीधे बना; BLOSUM62 सामान्य निर्धारित) — जो किसी ऐमीनो अम्ल युग्म को इससे स्कोर करता है कि वे वास्तविक संरेखणों में कितनी बार परस्पर प्रतिस्थापित होते हैं। एक बहु अनुक्रम संरेखण (MSA) अनेक अनुक्रम एक साथ संरेखित करता है (क्लस्टल व MUSCLE जैसी प्रगामी विधियाँ) और संरक्षित अभिप्राय व स्तंभ प्रकट करता है।

जातिवृत्त संरेखित अनुक्रमों से विकासीय संबंधों का वृक्ष बनाता है। दूरी विधियाँ (UPGMA, पड़ोसी-जुड़ाव) संरेखण को युग्मक दूरियों के आव्यूह में बदलकर उससे गुच्छन करती हैं; लक्षण विधियाँ स्तंभों से सीधे कार्य करती हैं — अधिकतम मितव्ययिता वह वृक्ष चुनती है जिसे सबसे कम परिवर्तन चाहिए, अधिकतम संभावना व बेज़ीय विधियाँ प्रतिस्थापन के किसी स्पष्ट मॉडल के अंतर्गत सर्वाधिक प्रायिक वृक्ष चुनती हैं। किसी वृक्ष की शाखाएँ बूटस्ट्रैप पुनःप्रतिचयन से परखी जाती हैं, जिसके मान बताते हैं कि कोई अनुजात कितनी बार पुनरावृत्त होता है। यही आणविक-विकास तर्क इस पेपर के आनुवंशिकी, कोशिकीय व आणविक जीवविज्ञान खंड में भी आता है।

5. जीनोमिकी, प्रोटीनोमिकी, उपापचयोमिकी; जीन पूर्वानुमान, टिप्पणीकरण व संरचना पूर्वानुमान

ओमिक्स विधाएँ अणुओं के समस्त वर्गों का एक साथ अध्ययन करती हैं। जीनोमिकी समग्र जीनोम का अध्ययन है — उसका अनुक्रम, संरचना व विभिन्नता; कार्यात्मक जीनोमिकी व अनुलेखनोमिकी (RNA-seq) पढ़ती हैं कि कौन-से जीन सक्रिय हैं। प्रोटीनोमिकी किसी प्रतिदर्श के समस्त प्रोटीनों का वृहत्-पैमाने पर अध्ययन है, जिस पर द्रव्यमान स्पेक्ट्रमिकी (खंड 2) का प्रभुत्व है, प्रायः द्वि-विम जेल या द्रव-वर्णलेखी पृथक्करण के बाद, और यह पहचान, प्रचुरता व अनुवादोत्तर रूपांतरण बताती है — वह जानकारी जो कोई जीनोम नहीं दे सकता क्योंकि एक जीन अनेक प्रोटीन रूप बनाता है। उपापचयोमिकी लघु-अणु उपापचयजों का प्रोफ़ाइलन MS व NMR प्रयोग कर करती है, और किसी कोशिका की वास्तविक कार्यिकीय अवस्था का निकटतम पठन है। मिलकर ये तंत्र जीवविज्ञान को पोषित करती हैं (खंड 6)।

जीन पूर्वानुमान किसी कच्चे जीनोम अनुक्रम में जीन खोजता है। प्रोकैरियोटों में यह खुले पठन खाके खोजता है — किसी आरंभ कोडॉन से किसी रोक कोडॉन तक इतने लंबे खंड कि वास्तविक हों — तथा प्रमोटर व राइबोसोम-बंधन स्थल। सुकेंद्रकियों में यह कठिनतर है क्योंकि जीन इंट्रॉनों से विभाजित होते हैं, अतः पूर्वानुमानक संकेतों (स्प्लाइस स्थल, आरंभ/रोक, कोडॉन-उपयोग सांख्यिकी) को संरेखित EST, cDNA व RNA-seq पाठों तथा ज्ञात जीनों से समजातता से मिले प्रमाण के साथ मिलाते हैं। कार्यात्मक टिप्पणीकरण फिर किसी पूर्वानुमानित जीन को एक संभावित कार्य सौंपता है — समजातता से (अभिलक्षित प्रोटीनों तक BLAST), संरक्षित डोमेनों से (Pfam, InterPro) और जीन ओंटोलॉजी व पथ डेटाबेसों (KEGG) जैसी नियंत्रित शब्दावलियों से।

संरचना पूर्वानुमान किसी प्रोटीन का आकार उसके अनुक्रम से अनुमानित करता है। द्वितीयक-संरचना पूर्वानुमान प्रत्येक अवशेष को कुंडली, रज्जु या कुंडलिका के रूप में वर्गीकृत करता है। त्रिविम (तृतीयक) संरचना पूर्वानुमान लंबे समय तक समजातता (तुलनात्मक) मॉडलन — किसी संबंधी प्रोटीन की ज्ञात संरचना पर मॉडल बनाना — व टेम्पलेट न होने पर आद्यंत वलन के बीच बँटा था; गहन-अधिगम विधियों ने हाल ही में अनेक प्रोटीनों हेतु सटीक पूर्वानुमान नियमित बनाया है। जैवरासायनिक डेटाबेसों में ज्ञान खोज — अनुक्रम, संरचना, पथ व साहित्य डेटाबेसों भर में आँकड़ा खनन — इन संचित आँकड़ों को नई परिकल्पनाओं में बदलती है, जैसे अनेक प्रविष्टियों भर के प्रतिरूपों से किसी प्रोटीन का कार्य या किसी एंज़ाइम का अधःस्तर पूर्वानुमानित करना।

6. मेटाजीनोमिकी, उपापचयी अभियांत्रिकी व तंत्र जीवविज्ञान

मेटाजीनोमिकी DNA को किसी पर्यावरण से सीधे लेकर अनुक्रमित करती है — मृदा, आँत, महासागर, कोई जैवरिएक्टर — उसमें के जीवों को पहले संवर्धित किए बिना। चूँकि अधिकांश सूक्ष्मजीव अभी प्रयोगशाला में नहीं उगाए जा सकते, मेटाजीनोमिकी किसी समग्र सूक्ष्मजीवी समुदाय के जीनों व जातियों का सर्वेक्षण करने, नवीन एंज़ाइम व पथ खोजने, और समुदायों की तुलना करने (जैसे किसी स्वस्थ बनाम रोगग्रस्त आँत) का मार्ग है। यह अध्याय 1 के अनुक्रमण को खंड 4 के जैवसूचना-विज्ञान (संयोजन, बिनन, वर्गिकीय व कार्यात्मक टिप्पणीकरण) से युग्मित करती है।

उपापचयी अभियांत्रिकी किसी कोशिका के उपापचयी जाल का किसी यौगिक के उत्पादन को सुधारने या रचने हेतु जानबूझकर पुनरभिकल्प है — एंज़ाइमों को अति-अभिव्यक्त, विलोपित या प्रस्तुत कर प्रवाह पुनर्निर्देशित करना, पुनर्भरण संदमन हटाना व सहकारक संतुलित करना। प्रवाह संतुलन विश्लेषण (FBA) जाल को स्थायी अवस्था पर मॉडल करता है (हर आंतरिक उपापचयज हेतु उत्पादन खपत के बराबर) और रससमीकरणमिति की बाधाओं के भीतर वृद्धि या उत्पाद लब्धि जैसे किसी उद्देश्य को अधिकतम करने वाला प्रवाह वितरण खोजने हेतु रैखिक क्रमादेशन प्रयुक्त करता है। इस प्रकार अभियांत्रिकीकृत सूक्ष्मजीव औषधियाँ, जैवईंधन व रसायन उत्पन्न करते हैं (आर्टेमिसिनिक-अम्ल यीस्ट एक मील का पत्थर है)। तंत्र जीवविज्ञान बड़ा कार्यक्रम है: यह समझना कि जीन, प्रोटीन व उपापचयज पृथक भागों के बजाय एक जाल के रूप में कैसे व्यवहार करते हैं, ओमिक्स आँकड़ों को अभिकलनात्मक मॉडलों से मिलाकर, ताकि समग्र का व्यवहार पूर्वानुमानित और, उपापचयी अभियांत्रिकी में, पुनरभिकल्पित किया जा सके।

🎯 मेटाजीनोमिकी संवर्धन क्यों छोड़ती है
अधिकांश पर्यावरणीय सूक्ष्मजीव कभी शुद्ध संवर्धन में नहीं उगाए गए, अतः संवर्धन-आधारित सर्वेक्षण उन्हें पूरी तरह चूक जाता है। प्रतिदर्श से सीधे निकाले DNA का अनुक्रमण संवर्धन को दरकिनार करता है और अतः समुदाय को जैसा वह है वैसा देखता है — इसीलिए मेटाजीनोमिकी ने प्रकट किया कि संवर्धन संग्रह कितनी सूक्ष्मजीवी विविधता चूक रहे थे।

मुख्य बिंदु

  • विभेदन d = lambda/2NA है, अतः इलेक्ट्रॉन (छोटा तरंगदैर्घ्य) प्रकाश से बेहतर; कॉन्फ़ोकल अनभिकेंद्रित प्रकाश अस्वीकृत करने व पतले प्रकाशीय काट देने हेतु एक छिद्र प्रयुक्त करता है।
  • बीयर–लैम्बर्ट A = epsilon·c·l मात्रा देता है; DNA 260 nm पर, प्रोटीन 280 nm पर अवशोषित करता है, अतः A260/A280 शुद्धता बताता है। CD द्वितीयक संरचना, MS सटीक द्रव्यमान, NMR विलयन संरचनाएँ देता है।
  • SDS-PAGE प्रोटीनों को द्रव्यमान से अलग करता है (SDS एकसमान आवेश देता है); ELISA, RIA, IHC व वेस्टर्न ब्लॉट प्रतिरक्षी प्रयुक्त करते हैं; प्रवाह कोशिकामिति एकल कोशिकाएँ गिनती व छाँटती है; ChIP-seq प्रोटीन–DNA बंधन जीनोम-व्यापी मानचित्रित करता है।
  • BLAST एक E-मान बताता है (छोटा अधिक सार्थक); संरेखण BLOSUM/PAM आव्यूहों व अंतराल दंडों सहित गतिक क्रमादेशन प्रयुक्त करता है; जातिवृत्त दूरी, मितव्ययिता, संभावना या बेज़ीय विधियों से, बूटस्ट्रैप से परखा।
  • ओमिक्स समस्त वर्ग एक साथ पढ़ती हैं (जीनोमिकी, MS द्वारा प्रोटीनोमिकी, उपापचयोमिकी); जीन पूर्वानुमान व कार्यात्मक टिप्पणीकरण (GO, KEGG, Pfam); मेटाजीनोमिकी संवर्धन छोड़ती है; FBA व तंत्र जीवविज्ञान जाल को मॉडल करते हैं।

अभ्यास प्रश्न (15)

उत्तर खोलने से पहले प्रत्येक प्रश्न हल करें। हर व्याख्या सही विकल्प के साथ लुभावना गलत विकल्प भी बताती है, क्योंकि अंक वहीं जाते हैं।

  1. किसी परंपरागत विस्तृत-क्षेत्र प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर कॉन्फ़ोकल सूक्ष्मदर्शी का लाभ यह है कि वह

    1. अनभिकेंद्रित प्रकाश अस्वीकृत करने व एक पतला प्रकाशीय काट प्रतिबिंबित करने हेतु एक छिद्र प्रयुक्त करता है
    2. प्रकाश के बजाय इलेक्ट्रॉन प्रयुक्त करता है
    3. किसी प्रतिदीप्तिकारी की आवश्यकता नहीं रखता
    4. केवल मृत कोशिकाओं पर कार्य करता है
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — अनभिकेंद्रित प्रकाश अस्वीकृत करने व एक पतला प्रकाशीय काट प्रतिबिंबित करने हेतु एक छिद्र प्रयुक्त करता है

    कॉन्फ़ोकल छिद्र अभिकेंद्र तल के ऊपर-नीचे से आए प्रकाश को रोकता है, अतः केवल एक अभिकेंद्रित प्रकाशीय काट संसूचक तक पहुँचता है, तीक्ष्ण प्रतिबिंब व त्रिविम ढेर देते हुए। वह अब भी प्रकाश व प्रतिदीप्तिकारी प्रयुक्त करता है और जीवित कोशिकाओं पर कार्य करता है; इलेक्ट्रॉन इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी हैं।

  2. एक DNA प्रतिदर्श 1 cm क्यूवेट में A260 = 0.40 देता है। A260 = 1.0 को 50 माइक्रोग्राम प्रति mL द्विरज्जुकी DNA मानते हुए, और यह देखते हुए कि प्रतिदर्श पढ़ने से पहले 20-गुना तनुकृत था, स्टॉक सांद्रता ______ माइक्रोग्राम प्रति mL है।

    संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।

    उत्तर देखें

    उत्तर: 400

    तनुकृत प्रतिदर्श 0.40 × 50 = 20 माइक्रोग्राम प्रति mL है; 20-गुना तनुकरण से गुणा करने पर स्टॉक, 20 × 20 = 400 माइक्रोग्राम प्रति mL मिलता है। तनुकरण भूलना 20 देता है, और 50 के बजाय प्रोटीन गुणक प्रयोग करना दूसरी सामान्य भूल है।

  3. संख्यात्मक द्वारक 1.0 के किसी अभिदृश्यक को 500 nm तरंगदैर्घ्य के प्रकाश से प्रयोग करने पर, ऐबे विभेदन सीमा d = lambda/(2·NA) ______ nm है।

    संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।

    उत्तर देखें

    उत्तर: 250

    d = lambda/(2·NA) = 500/(2 × 1.0) = 250 nm। इसीलिए एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी लगभग एक-चौथाई माइक्रोमीटर से बहुत निकट की वस्तुएँ विभेदित नहीं कर सकता; बेहतर करने हेतु छोटा तरंगदैर्घ्य (इलेक्ट्रॉन) या उच्चतर NA चाहिए।

  4. एक शोधित द्विरज्जुकी DNA तैयारी से लगभग किस A260/A280 अनुपात की अपेक्षा है?

    1. 1.8, कम मान प्रोटीन संदूषण इंगित करते हुए
    2. 0.5
    3. 4.0
    4. सदा ठीक 1.0
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — 1.8, कम मान प्रोटीन संदूषण इंगित करते हुए

    स्वच्छ DNA लगभग 1.8 पढ़ता है (RNA लगभग 2.0); प्रोटीन, जो 280 nm पर अवशोषित करता है, अनुपात नीचे खींचता है, अतः 1.8 से काफ़ी कम मान प्रोटीन संदूषण दर्शाता है। अनुपात एक शुद्धता जाँच है, कोई स्थिर स्थिरांक नहीं।

  5. सैंडविच ELISA मुख्यतः किसलिए प्रयुक्त होती है?

    1. दो प्रतिरक्षियों के बीच पकड़े किसी विशिष्ट प्रतिजन का संसूचन व मात्रा निर्धारण
    2. प्रोटीनों को आकार से अलग करना
    3. DNA प्रवर्धित करना
    4. किसी जीनोम का अनुक्रमण
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — दो प्रतिरक्षियों के बीच पकड़े किसी विशिष्ट प्रतिजन का संसूचन व मात्रा निर्धारण

    सैंडविच ELISA में एक ग्रहण प्रतिरक्षी प्रतिजन से बँधता है और एक दूसरा, एंज़ाइम-युग्मित संसूचन प्रतिरक्षी उस पर किसी अन्य एपिटोप से बँधता है, अतः उत्पन्न रंग उच्च विशिष्टता से प्रतिजन मापता है। आकार पृथक्करण वैद्युतकण-संचलन है, प्रवर्धन PCR, और अनुक्रमण एक भिन्न विधि।

  6. प्रवाह कोशिकामिति किसके गुण मापती है?

    1. एक धारा में एक-एक कर लेज़र के आगे से गुज़ारी गई एकल कोशिकाओं के
    2. अक्षत ऊतक खंडों के
    3. जेल पर नग्न DNA के
    4. गैस-प्रावस्था आयनों के
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — एक धारा में एक-एक कर लेज़र के आगे से गुज़ारी गई एकल कोशिकाओं के

    प्रवाह कोशिकामिति कोशिकाओं को एक-एक कर लेज़र के आगे बहाती है और उनका प्रकाश प्रकीर्णन व प्रतिदीप्ति पढ़ती है, उन्हें चिह्नकों से गिनते व अभिलक्षित करते हुए; FACS उन्हें भौतिक रूप से छाँटता है। ऊतक खंड ऊतकविज्ञान हेतु हैं, जेल वैद्युतकण-संचलन हेतु और गैस-प्रावस्था आयन द्रव्यमान स्पेक्ट्रमिकी हेतु।

  7. एक BLAST खोज एक अति छोटे E-मान (जैसे 1e-50) वाला हिट लौटाती है। इसका अर्थ है कि मिलान

    1. अत्यधिक सार्थक — उस आकार के डेटाबेस में संयोगवश उत्पन्न होने की अति अल्प संभावना
    2. असार्थक — संयोगवश अपेक्षित
    3. ठीक 100% समरूपता
    4. किसी वैश्विक संरेखण से
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — अत्यधिक सार्थक — उस आकार के डेटाबेस में संयोगवश उत्पन्न होने की अति अल्प संभावना

    E-मान उस आकार के डेटाबेस में कम से कम उस स्कोर के संयोगवश अपेक्षित हिटों की संख्या है, अतः अति छोटा E-मान बताता है कि संयोग एक अति अल्प-संभावित व्याख्या है और समानता सार्थक है (संभवतः समजातता)। यह प्रतिशत समरूपता नहीं है, और BLAST स्थानीय संरेखण प्रयुक्त करता है, वैश्विक नहीं।

  8. केवल एक जीनोम अनुक्रम प्रोटीनोमिकी को क्यों प्रतिस्थापित नहीं कर सकता?

    1. एक जीन स्प्लाइसिंग व अनुवादोत्तर रूपांतरण से अनेक प्रोटीन रूप दे सकता है, जो जीनोम नहीं दिखाता
    2. जीनोम हर प्रकार से प्रोटीनोम से अधिक जानकारी रखता है
    3. प्रोटीन जीनोम के बाहर कूटित होते हैं
    4. प्रोटीनोम कभी नहीं बदलता
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — एक जीन स्प्लाइसिंग व अनुवादोत्तर रूपांतरण से अनेक प्रोटीन रूप दे सकता है, जो जीनोम नहीं दिखाता

    प्रोटीनोम गतिशील है और जीन संख्या से बड़ा: वैकल्पिक स्प्लाइसिंग, प्रोटीन-अपघटनी प्रसंस्करण व अनुवादोत्तर रूपांतरण का अर्थ है कि एक जीन अनेक प्रोटीन जातियाँ देता है, और प्रचुरताएँ कोशिका अवस्था के साथ बदलती हैं। जीनोम भागों को सूचीबद्ध करता है; प्रोटीनोमिकी मापती है कि कौन-से प्रोटीन, कितने और किस रूपांतरित रूप में वास्तव में उपस्थित हैं।

  9. SDS-PAGE में प्रोटीन अनिवार्यतः अणुभार से अलग होते हैं क्योंकि SDS

    1. प्रोटीन को विकृत करता है और प्रति इकाई द्रव्यमान लगभग एकसमान ऋणावेश से लेपित करता है
    2. प्रोटीन को वलित व उसका मूल आवेश बनाए रखता है
    3. प्रोटीन को उसके समविभव बिंदु से अलग करता है
    4. लंबाई के समानुपाती धनावेश जोड़ता है
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — प्रोटीन को विकृत करता है और प्रति इकाई द्रव्यमान लगभग एकसमान ऋणावेश से लेपित करता है

    SDS प्रोटीनों को खोलता है और शृंखला भर बँधता है, लगभग स्थिर आवेश-से-द्रव्यमान अनुपात देते हुए, अतः वैद्युतकण गतिशीलता केवल आकार पर निर्भर करती है और जेल अणुभार बताता है। मूल आवेश/आकार रखना नेटिव PAGE है, और pI से अलग करना समविभव केंद्रण।

  10. ChIP अनुक्रमण (ChIP-seq) किसके निर्धारण हेतु प्रयुक्त होता है?

    1. किसी दिए प्रोटीन का समस्त जीनोम भर DNA से बंधन स्थान
    2. किसी प्रोटीन का संपूर्ण ऐमीनो-अम्ल अनुक्रम
    3. किसी कोशिका का उपापचयज प्रोफ़ाइल
    4. किसी प्राइमर का गलनांक
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — किसी दिए प्रोटीन का समस्त जीनोम भर DNA से बंधन स्थान

    ChIP-seq क्रोमैटिन को तिर्यक-बंधित करता है, किसी लक्ष्य प्रोटीन (एक अनुलेखन कारक या रूपांतरित हिस्टोन) को प्रतिरक्षी से प्रतिरक्षा-अवक्षेपित करता है और सह-अवक्षेपित DNA अनुक्रमित करता है, अतः जीनोम भर उसके बंधन स्थल शिखरों के रूप में प्रकट होते हैं। यह प्रोटीन–DNA बंधन स्थल बताता है, प्रोटीन अनुक्रम, उपापचयज या प्राइमर Tm नहीं।

  11. अनुक्रम संरेखण के विषय में कौन-से कथन सही हैं? सभी लागू चुनें।

    1. नीडलमैन–वुन्श वैश्विक संरेखण देता है और स्मिथ–वॉटरमैन स्थानीय
    2. BLOSUM व PAM प्रतिस्थापन आव्यूह हैं जो ऐमीनो-अम्ल युग्मों को स्कोर करते हैं
    3. दोनों एल्गोरिथम अंतराल दंडों सहित गतिक क्रमादेशन प्रयुक्त करते हैं
    4. एक बहु अनुक्रम संरेखण ठीक दो अनुक्रम संरेखित करता है
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — नीडलमैन–वुन्श वैश्विक संरेखण देता है और स्मिथ–वॉटरमैन स्थानीय; B — BLOSUM व PAM प्रतिस्थापन आव्यूह हैं जो ऐमीनो-अम्ल युग्मों को स्कोर करते हैं; C — दोनों एल्गोरिथम अंतराल दंडों सहित गतिक क्रमादेशन प्रयुक्त करते हैं

    नीडलमैन–वुन्श वैश्विक है और स्मिथ–वॉटरमैन स्थानीय; दोनों अंतराल दंडों सहित गतिक-क्रमादेशन एल्गोरिथम हैं; BLOSUM व PAM ऐमीनो-अम्ल प्रतिस्थापन स्कोर करते हैं। यह दावा कि बहु अनुक्रम संरेखण ठीक दो अनुक्रम संरेखित करता है, परिभाषा से ग़लत है — वह तीन या अधिक अनुक्रम संरेखित करता है, दो नहीं।

  12. सुकेंद्रकी जीन पूर्वानुमान प्रोकैरियोटी जीन पूर्वानुमान से मुख्यतः इसलिए कठिनतर है कि सुकेंद्रकी जीन

    1. इंट्रॉनों से विभाजित होते हैं, अतः उन्हें खोजने हेतु एक निरंतर खुला पठन खाका पर्याप्त नहीं
    2. कोई आरंभ या रोक कोडॉन नहीं रखते
    3. कभी अनुलेखित नहीं होते
    4. अनुक्रम में सभी समरूप होते हैं
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — इंट्रॉनों से विभाजित होते हैं, अतः उन्हें खोजने हेतु एक निरंतर खुला पठन खाका पर्याप्त नहीं

    चूँकि एक्सॉन इंट्रॉनों से बाधित होते हैं, एक सुकेंद्रकी कूटन क्षेत्र कोई अकेला अबाधित ORF नहीं है, अतः पूर्वानुमानकों को स्प्लाइस स्थल खोजकर उन्हें RNA-seq/EST प्रमाण व समजातता से मिलाना पड़ता है। प्रोकैरियोटी जीन अधिकांशतः निरंतर ORF हैं, इसीलिए वहाँ केवल ORF-खोज कहीं बेहतर काम करती है।

  13. किसी उपापचयी जाल का प्रवाह संतुलन विश्लेषण (FBA) एक स्थायी अवस्था मानता है और रैखिक क्रमादेशन प्रयुक्त करता है

    1. रससमीकरणमितीय बाधाओं के भीतर वृद्धि जैसे किसी उद्देश्य को अधिकतम करने वाला प्रवाह वितरण खोजने हेतु
    2. हर एंज़ाइम की ठीक सांद्रता मापने हेतु
    3. जीव के जीनोम का अनुक्रमण करने हेतु
    4. प्रत्येक एंज़ाइम की त्रिविम संरचना पूर्वानुमानित करने हेतु
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — रससमीकरणमितीय बाधाओं के भीतर वृद्धि जैसे किसी उद्देश्य को अधिकतम करने वाला प्रवाह वितरण खोजने हेतु

    FBA स्थायी अवस्था पर द्रव्यमान संतुलन (हर आंतरिक उपापचयज का निवल उत्पादन शून्य) को रससमीकरणमिति से रैखिक बाधाओं के रूप में लगाता है, फिर जैवभार या उत्पाद प्रवाह जैसे किसी उद्देश्य को रैखिक क्रमादेशन से इष्टतम करता है। उसे बलगतिक स्थिरांक या सांद्रताएँ नहीं चाहिए, और वह कोई अनुक्रमण या संरचना विधि नहीं है।

  14. मेटाजीनोमिकी विशिष्ट है क्योंकि वह

    1. जीवों को पहले संवर्धित किए बिना किसी पर्यावरणीय प्रतिदर्श से सीधे लिए DNA का अनुक्रमण करती है
    2. केवल शुद्ध प्रयोगशाला संवर्धनों पर कार्य करती है
    3. केवल उपापचयज मापती है
    4. किसी अनुक्रमण की आवश्यकता नहीं रखती
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — जीवों को पहले संवर्धित किए बिना किसी पर्यावरणीय प्रतिदर्श से सीधे लिए DNA का अनुक्रमण करती है

    मेटाजीनोमिकी समुदाय DNA को मृदा, आँत या जल से सीधे अनुक्रमित करती है, अतः वह उन अनेक सूक्ष्मजीवों को पकड़ती है जो संवर्धित नहीं हो सकते — एक शुद्ध-संवर्धन विधि का विपरीत। यह अनुक्रमण-आधारित उपागम है, कोई उपापचयज परख नहीं।

  15. किसी शोधित पेप्टाइड का सटीक अणुभार और, खंडन द्वारा, उसका अनुक्रम निर्धारित करने हेतु आप कौन-सी तकनीक चुनेंगे?

    1. अनुबंधी द्रव्यमान स्पेक्ट्रमिकी (MS/MS)
    2. ऐगारोज़ जेल वैद्युतकण-संचलन
    3. 260 nm पर UV–दृश्य स्पेक्ट्रमिकी
    4. प्रकाश सूक्ष्मदर्शिकी
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — अनुबंधी द्रव्यमान स्पेक्ट्रमिकी (MS/MS)

    द्रव्यमान स्पेक्ट्रमिकी m/z से सटीक द्रव्यमान देती है, और अनुबंधी MS पेप्टाइड को खंडित कर उसका अनुक्रम पढ़ती है — प्रोटीनोमिकी का केंद्र। ऐगारोज़ जेल न्यूक्लिक अम्लों हेतु हैं, A260 DNA सांद्रता मापता है, और प्रकाश सूक्ष्मदर्शिकी कोशिकाएँ प्रतिबिंबित करती है, इनमें से कोई पेप्टाइड द्रव्यमान या अनुक्रम नहीं देता।