पुनर्योगज DNA प्रौद्योगिकी व आणविक उपकरण — एंज़ाइम, वाहक, क्लोनन, PCR, ब्लॉटिंग व जीनोम संपादन

जैवप्रौद्योगिकी पेपर के खंड 6 का पहला अध्याय पाठ्यक्रम में सूचीबद्ध पहले दो उपशीर्षक लेता है: पुनर्योगज DNA प्रौद्योगिकी व आणविक उपकरण। यह उन एंज़ाइमों से आरंभ होता है जो DNA काटते व जोड़ते हैं — प्रतिबंधन व रूपांतरण एंज़ाइम, लाइगेज़ व पॉलिमरेज़ — फिर वे वाहक जो किसी जीन को वहन करते हैं (प्लाज़्मिड, जीवाणुभोजी, कॉस्मिड, Ti प्लाज़्मिड, जीवाणु व यीस्ट कृत्रिम गुणसूत्र, तथा अभिव्यक्ति वाहक)। फिर कार्य स्वयं: cDNA व जीनोमी पुस्तकालय, जीन पृथक्करण व क्लोनन, पुनर्योगज प्रोटीन उत्पादन की रणनीतियाँ, ट्रांसपोज़ॉन व जीन लक्ष्यन, तथा पुनर्योजन-आधारित क्लोनन। आणविक उपकरण आगे आते हैं: बहुलकीयकरण शृंखला अभिक्रिया, न्यूक्लिक अम्ल लेबलन तथा सैंगर व अगली-पीढ़ी अनुक्रमण, सदर्न व नॉर्दर्न ब्लॉटिंग व इन-सिटू संकरण, RAPD व RFLP सहित DNA फ़िंगरप्रिंटिंग, स्थल-निर्देशित उत्परिवर्तजनन, CRISPR–Cas, जैवसंवेदक, DNA–प्रोटीन व प्रोटीन–प्रोटीन अन्योन्यक्रियाओं के उपकरण, तथा जीनोमी व प्रोटीनोमी-आधारित उपागम।

1. प्रतिबंधन व रूपांतरण एंज़ाइम, लाइगेज़ व पॉलिमरेज़

प्रतिबंधन–रूपांतरण तंत्र किसी जीवाणु की पराए DNA के विरुद्ध रक्षा है: एक प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज़ DNA को किसी विशिष्ट अनुक्रम पर काटता है, जबकि एक रूपांतरण मेथिलट्रांसफ़रेज़ उस अनुक्रम की परपोषी की अपनी प्रतियों को मेथिलीकृत करता है ताकि वे न कटें। प्रकार II एंज़ाइम क्लोनन में प्रयुक्त होते हैं, क्योंकि वे किसी परिभाषित, प्रायः पैलिंड्रोमी, पहचान स्थल पर या उसके अति निकट काटते हैं (दोनों रज्जुकों पर 5-प्राइम से 3-प्राइम वही पढ़ते हुए) और केवल Mg²⁺ माँगते हैं। एक कटाव 5-प्राइम या 3-प्राइम एकरज्जुकी अधिलंब (चिपचिपा सिरा) या एक कुंठित सिरा छोड़ सकता है। EcoRI, GAATTC को G व A के बीच काटकर 5-प्राइम AATT अधिलंब छोड़ता है; SmaI, CCCGGG को बीच में काटकर कुंठित सिरे छोड़ता है; PstI, 3-प्राइम अधिलंब छोड़ता है। आइसोस्किज़ोमर समान स्थल पहचानते हैं; संगत सिरे वे अधिलंब हैं जो भिन्न एंज़ाइमों से भी तापानुशीतित हो सकते हैं (BamHI व BglII दोनों GATC छोड़ते हैं)। प्रकार I व प्रकार III एंज़ाइम अपने स्थल से दूर काटते हैं और सटीक क्लोनन हेतु उपयोगी नहीं।

एक खंड किसी वाहक में DNA लाइगेज़ द्वारा जोड़ा जाता है, जो एक 3-प्राइम हाइड्रॉक्सिल व एक 5-प्राइम फ़ॉस्फ़ेट के बीच फ़ॉस्फ़ोडाइएस्टर बंध बनाता है; T4 DNA लाइगेज़ चिपचिपे व कुंठित दोनों सिरे जोड़ता है। उपकरण-समुच्चय के अन्य एंज़ाइम: DNA पॉलिमरेज़ I व उसका क्लेनो खंड (5-प्राइम अधिलंबों का पूरण, लेबलन), प्रतीप अनुलेखक (RNA से cDNA), टर्मिनल ट्रांसफ़रेज़ (समबहुलक पुच्छ), क्षारीय फ़ॉस्फ़ेटेज़ (वाहक से 5-प्राइम फ़ॉस्फ़ेट हटाता है ताकि वह स्व-बंधित न हो), तथा पॉलिन्यूक्लिओटाइड काइनेज़ (5-प्राइम फ़ॉस्फ़ेट जोड़ता है, सिरा-लेबलन हेतु)। एक कटा वाहक प्रायः बंधन से पहले विफ़ॉस्फ़ोरिलीकृत किया जाता है ठीक इसलिए कि उसे बंद होने हेतु प्रवेशक के फ़ॉस्फ़ेट चाहिए, जो उत्पाद में रिक्त स्व-बंधित वाहक दबाता है।

🧠 चिपचिपे सिरे क्यों वरीय हैं
चिपचिपा-सिरा कटाव पूरक अधिलंब छोड़ता है जो क्षार-युग्मित होकर प्रवेशक व वाहक को लाइगेज़ द्वारा सील किए जाने से पहले साथ रखते हैं, अतः बंधन दक्ष होता है और दो भिन्न एंज़ाइम प्रयोग करने पर दिशात्मक। कुंठित सिरों के पास तापानुशीतित होने को कुछ नहीं, अतः वे धीरे और किसी भी दिशा में बंधते हैं। अपेक्षा करें कि कोई GATE प्रश्न पूछे कि दो एंज़ाइमों से द्वि-पाचन दिशात्मक क्लोनन क्यों देता है।

2. क्लोनन वाहक — प्लाज़्मिड, फ़ेज, कॉस्मिड, Ti, BAC, YAC, तथा अभिव्यक्ति वाहक

एक क्लोनन वाहक में एक प्रतिकृतियन उद्गम, एक या अधिक चयनीय चिह्नक, तथा अद्वितीय प्रतिबंधन स्थलों सहित एक बहु क्लोनन स्थल (पॉलीलिंकर) होने चाहिए। प्लाज़्मिड (pUC, pBR322) लगभग 10 kb तक के प्रवेशक वहन करते हैं और रोज़मर्रा के वाहक हैं; pUC वाहक lacZ-अल्फ़ा खंड द्वारा नीला–श्वेत जाँच जोड़ते हैं, जहाँ पॉलीलिंकर में कोई प्रवेशक बीटा-गैलैक्टोसिडेज़ को बाधित करता है अतः उपनिवेश X-gal पर श्वेत रहता है जबकि रिक्त वाहक नीला हो जाता है। जीवाणुभोजी लैम्ब्डा वाहक लगभग 9–23 kb लेते हैं और DNA को इन विट्रो दक्षता से संवेष्टित करते हैं, इसीलिए वे पुस्तकालयों के अनुकूल हैं; कॉस्मिड एक प्लाज़्मिड उद्गम को लैम्ब्डा cos स्थलों से मिलाकर लगभग 45 kb तक संवेष्टित करते हैं। उससे बड़े हैं BAC (जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र, F प्लाज़्मिड पर आधारित, ~100–300 kb) व YAC (यीस्ट कृत्रिम गुणसूत्र, जिनमें एक गुणसूत्रबिंदु, दो टीलोमीयर व एक उद्गम होते हैं और जो सैकड़ों kb से एक मेगाबेस से अधिक वहन करते हैं)। वाहक जितना बड़ा प्रवेशक लेता है, पूरे जीनोम को उतने कम क्लोन चाहिए, पर DNA सँभालना उतना कठिन।

एक अभिव्यक्ति वाहक किसी जीन को वहन करने से अधिक करता है — वह परपोषी को उसका अनुलेखन व अनुवाद कराता है। वह एक प्रमोटर (प्रबल व प्रायः नियमनीय, जैसे E. coli में lac, tac या T7 प्रमोटर), आरंभ कोडॉन से सही अंतराल पर एक राइबोसोम-बंधन स्थल, तथा एक समापक जोड़ता है; एक सुकेंद्रकी अभिव्यक्ति वाहक एक पॉलीऐडेनिलीकरण संकेत व प्रायः एक संवर्धक जोड़ता है। उपयोगी अतिरिक्त हैं एक आसक्ति टैग (निकल-आसक्ति शोधन हेतु His₆ टैग, GST, या एक एपिटोप टैग), प्रोटीन को निर्यात करने हेतु एक संकेत/स्रावण अनुक्रम, तथा बाद में टैग काटने हेतु एक प्रोटिएज़ स्थल। एग्रोबैक्टीरियम का Ti प्लाज़्मिड (खंड 5) पारजीनी पादप बनाने का वाहक है; प्रमोटर व परपोषी का चयन ही उस वाहक को, जो केवल क्लोन करता है, उससे अलग करता है जो प्रोटीन उत्पन्न करता है।

3. पुस्तकालय, जीन पृथक्करण व क्लोनन; ट्रांसपोज़ॉन, जीन लक्ष्यन व पुनर्योजन-आधारित क्लोनन

एक जीनोमी पुस्तकालय किसी जीव के समस्त जीनोम को आच्छादित करने वाले क्लोनों का संग्रह है; एक cDNA पुस्तकालय किसी कोशिका के mRNA के प्रतीप-अनुलेखन से बनता है, अतः उसमें केवल वहाँ अभिव्यक्त जीन होते हैं और, सुकेंद्रकियों में, केवल एक्सॉन (कोई इंट्रॉन नहीं) — इसीलिए जीवाणुओं में अभिव्यक्ति हेतु कोई मानव जीन cDNA से क्लोन किया जाता है, क्योंकि जीवाणु स्प्लाइस नहीं कर सकते। किसी जीनोम को किसी दी प्रायिकता से आच्छादित करने हेतु आवश्यक क्लोनों की संख्या क्लार्क–कार्बन सूत्र N = ln(1 − P)/ln(1 − f) का अनुसरण करती है, जहाँ f एक प्रवेशक में जीनोम का अंश व P आच्छादन की वांछित प्रायिकता है। किसी जीन को पुस्तकालय में जाँच से पाया जाता है — किसी लेबल्ड प्रोब से उपनिवेश या पट्टिका संकरण, किसी अभिव्यक्ति पुस्तकालय की प्रतिरक्षी जाँच, या जीन-विशिष्ट प्राइमरों से PCR।

पुनर्योगज प्रोटीन उत्पादन की रणनीतियाँ ऊपर के टुकड़े मिलाती हैं: कूटन अनुक्रम (सुकेंद्रकी प्रोटीन हेतु cDNA) को उपयुक्त प्रमोटर व टैग सहित किसी अभिव्यक्ति वाहक में क्लोन करें, सही परपोषी (E. coli, यीस्ट या स्तनधारी कोशिकाएँ — खंड 5) रूपांतरित करें, अभिव्यक्ति प्रेरित करें, और शोधित करें (खंड 5 डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण)। कोडॉन अनुकूलन, विलेय-अभिव्यक्ति रणनीति का चयन व स्रावण सभी उपज बढ़ाते हैं। ट्रांसपोज़ॉन — चल DNA तत्व जो ट्रांसपोज़ेज़ द्वारा चलते हैं — प्रवेशी उत्परिवर्तजनन व जीन टैगन हेतु उपकरण के रूप में प्रयुक्त होते हैं, किसी जीन को बाधित कर उसका स्थान चिह्नित करते हुए। जीन लक्ष्यन किसी चुने जीन को समजात पुनर्योजन द्वारा प्रतिस्थापित या बाधित करता है (खंड 5, नॉक-आउट)। पुनर्योजन-आधारित क्लोनन — Gateway तंत्र (फ़ेज लैम्ब्डा att स्थलों व उसके इंटीग्रेज़/एक्सिज़नेज़ का उपयोग) तथा Cre–lox व गिब्सन संयोजन (एक एक्सोन्यूक्लिएज़, पॉलिमरेज़ व लाइगेज़ जो अतिव्यापी खंडों को एक ही अभिक्रिया में जोड़ते हैं) — अद्वितीय प्रतिबंधन स्थलों पर निर्भर हुए बिना DNA को चलाता या संयोजित करता है, जो आधुनिक, प्रतिबंधन-स्थल-स्वतंत्र निर्माण को संभव बनाता है।

4. PCR, न्यूक्लिक अम्ल लेबलन, तथा सैंगर व अगली-पीढ़ी अनुक्रमण

बहुलकीयकरण शृंखला अभिक्रिया (PCR) किसी परिभाषित DNA क्षेत्र को तीन चरणों के बार-बार चक्रों से घातांकी रूप से प्रवर्धित करती है: विकृतन (~94–95 °C, रज्जुक अलग होते हैं), तापानुशीतन (~50–65 °C, दो प्राइमर विपरीत रज्जुकों पर लक्ष्य के सिरों से बँधते हैं) व विस्तारण (~72 °C, Taq जैसा एक तापस्थायी पॉलिमरेज़ प्रत्येक रज्जुक को 5-प्राइम से 3-प्राइम प्रतिलिपि करता है)। चूँकि प्रत्येक चक्र नए व पुराने दोनों रज्जुक प्रतिलिपि करता है, लक्ष्य प्रत्येक चक्र दुगुना होता है: n चक्रों के बाद मात्रा आदर्श स्थिति में 2ⁿ से गुणित होती है (दो प्राइमरों से घिरा विशिष्ट उत्पाद पहले कुछ चक्रों के बाद घातांकी रूप से संचित होता है)। तापानुशीतन ताप प्राइमरों के गलनांक से कुछ डिग्री नीचे रखा जाता है; बहुत कम अविशिष्ट उत्पाद देता है। रूपांतर: RT-PCR (पहले RNA का प्रतीप-अनुलेखन, mRNA से प्रवर्धन हेतु), qPCR / वास्तविक-काल PCR (एक प्रतिदीप्त रंजक या प्रोब प्रत्येक चक्र उत्पाद अनुसरित करता है, और देहली चक्र Ct जितना अधिक टेम्पलेट था उतना कम होता है, अतः Ct आरंभिक मात्रा मापता है), तथा नेस्टेड, मल्टिप्लेक्स व उपनिवेश PCR।

न्यूक्लिक अम्ल प्रोब के रूप में उपयोग हेतु लेबल किए जाते हैं — रेडियोसक्रिय रूप से (निक अनुवादन, यादृच्छिक प्राइमन या पॉलिन्यूक्लिओटाइड काइनेज़ से सिरा-लेबलन द्वारा ³²P) या अरेडियोसक्रिय रूप से (एंज़ाइम-युग्मित प्रतिरक्षियों द्वारा संसूचित बायोटिन या डाइगॉक्सिजेनिन, या एक सीधा प्रतिदीप्तिकारी)। सैंगर (डाइडीऑक्सी) अनुक्रमण टेम्पलेट को DNA पॉलिमरेज़ से शृंखला-समापक डाइडीऑक्सीन्यूक्लिओटाइडों (ddNTP) के एक छोटे अंश की उपस्थिति में प्रतिलिपि करता है, जिनमें 3-प्राइम हाइड्रॉक्सिल नहीं होता, अतः जहाँ भी एक जुड़े संश्लेषण रुक जाता है; हर लंबाई के खंडों का मिश्रण आकार से अलग किया जाता है (केशिका वैद्युतकण-संचलन), और आधुनिक रंजक-समापक अनुक्रमण में प्रत्येक ddNTP एक भिन्न प्रतिदीप्तिकारी वहन करता है, अतः अनुक्रम रंगीन शिखरों की सीढ़ी के रूप में पढ़ा जाता है। अगली-पीढ़ी अनुक्रमण (NGS) लाखों खंड समानांतर अनुक्रमित करता है — इलुमिना सेतु प्रवर्धन व प्रतिवर्ती रंजक-समापक संश्लेषण-द्वारा-अनुक्रमण प्रयोग कर बहुत उच्च प्रवाह पर लघु पाठ पढ़ता है; दीर्घ-पाठ मंच (नैनोछिद्र, एकल-अणु वास्तविक-काल) उच्चतर प्रति-क्षार त्रुटि की लागत पर कहीं लंबे खंड पढ़ते हैं। NGS ने समस्त जीनोम, अनुलेखनोम (RNA-seq) व मेटाजीनोम को नियमित बनाया।

🎯 डाइडीऑक्सीन्यूक्लिओटाइड शृंखला क्यों रोकता है
DNA संश्लेषण प्रत्येक नए न्यूक्लिओटाइड को बढ़ते रज्जुक के मुक्त 3-प्राइम हाइड्रॉक्सिल से जोड़ता है। डाइडीऑक्सीन्यूक्लिओटाइड में 3-प्राइम हाइड्रॉक्सिल नहीं होता, अतः एक बार समाविष्ट होने पर अगला फ़ॉस्फ़ोडाइएस्टर बंध नहीं बन सकता और वह रज्जुक वहीं समाप्त होता है। जिस लंबाई पर वह समाप्त होता है वह उस क्षार की स्थिति बताती है — सैंगर अनुक्रमण का समस्त आधार।

5. ब्लॉटिंग, इन-सिटू संकरण व DNA फ़िंगरप्रिंटिंग (RAPD, RFLP)

ब्लॉट, और प्रत्येक क्या संसूचित करता है
ब्लॉटलक्ष्यपृथक्कृत फिर संसूचित
सदर्नDNAजेल वैद्युतकण-संचलन, झिल्ली पर स्थानांतरण, लेबल्ड DNA प्रोब से संकरण
नॉर्दर्नRNAवही, एक प्रोब सहित, किसी अनुलेख का आकार व मात्रा मापने हेतु
वेस्टर्नप्रोटीनSDS-PAGE, स्थानांतरण, एक प्रतिरक्षी से संसूचन (अध्याय 2 देखें)

सदर्न ब्लॉटिंग (एडविन सदर्न के नाम पर; अन्य उपमा से नामित) प्रतिबंधन-पाचित DNA को जेल पर अलग करती है, एक झिल्ली पर स्थानांतरित करती है और किसी चुने अनुक्रम को एक लेबल्ड प्रोब से संसूचित करती है — यह उत्तर देती है "क्या यह अनुक्रम उपस्थित है, और किस आकार के खंड में?"। नॉर्दर्न ब्लॉटिंग RNA हेतु वही करती है और अतः किसी जीन की अभिव्यक्ति मापती है। इन-सिटू संकरण किसी लेबल्ड प्रोब को स्थिरीकृत कोशिकाओं या ऊतक के भीतर DNA या RNA पर लगाता है, अतः किसी अनुलेख या गुणसूत्री स्थल को स्वस्थाने पाया जाता है; FISH (प्रतिदीप्ति इन-सिटू संकरण) किसी जीन को मानचित्रित करने या प्रति-संख्या परिवर्तन संसूचित करने हेतु गुणसूत्रों पर प्रतिदीप्त प्रोब प्रयोग करता है।

DNA फ़िंगरप्रिंटिंग पुनरावृत्त अनुक्रमों में विभिन्नता से व्यक्तियों को विभेदित करती है। RFLP (प्रतिबंधन खंड लंबाई बहुरूपता) किसी ऐसे उत्परिवर्तन को, जो कोई प्रतिबंधन स्थल बनाता या नष्ट करता है, या किसी पुनरावृत्ति में लंबाई अंतर को, किसी प्रतिबंधन एंज़ाइम द्वारा उत्पन्न खंडों के आकार में परिवर्तन के रूप में पढ़ती है, जो किसी सदर्न ब्लॉट से प्रकट होता है; इसे अच्छी गुणवत्ता का DNA चाहिए और यह श्रमसाध्य है पर अत्यधिक पुनरुत्पाद्य व सहप्रभावी है। RAPD (यादृच्छिक प्रवर्धित बहुरूपी DNA) कम तापानुशीतन ताप पर स्वेच्छ अनुक्रम के एकल लघु प्राइमरों सहित PCR प्रयोग करता है, जो जहाँ भी लगभग मिलान पाएँ वहाँ प्राइम करते हैं, अतः पट्टियों का प्रतिरूप जीनोम भर की बहुरूपताएँ परावर्तित करता है; इसे कोई अनुक्रम ज्ञान व कम DNA चाहिए पर यह प्रभावी है और दशाओं के प्रति संवेदी, अतः प्रयोगशालाओं के बीच कम पुनरुत्पाद्य। आधुनिक प्रोफ़ाइलन अधिकांशतः केशिका वैद्युतकण-संचलन से पढ़े STR (सूक्ष्मउपग्रह) चिह्नकों की ओर बढ़ गया है।

6. स्थल-निर्देशित उत्परिवर्तजनन, CRISPR–Cas, जैवसंवेदक, अन्योन्यक्रिया उपकरण व ओमिक्स उपागम

स्थल-निर्देशित उत्परिवर्तजनन किसी चुनी स्थिति पर एक परिभाषित परिवर्तन — एक बिंदु उत्परिवर्तन, प्रवेश या विलोपन — प्रस्तुत करता है, किसी प्रोटीन की संरचना–कार्य जाँचने हेतु। क्लासिक विधि वांछित परिवर्तन वहन करने वाला एक ऑलिगोन्यूक्लिओटाइड प्राइमर प्रयोग करती है, जो टेम्पलेट पर एक नए रज्जुक का संश्लेषण प्राइम करता है अतः उत्परिवर्तन प्रतिलिपि हो जाता है; आधुनिक किट उत्परिवर्तजनक प्राइमरों से पूरे प्लाज़्मिड को प्रवर्धित करते हैं और फिर मेथिलीकृत जनक टेम्पलेट को DpnI से पचाते हैं, जो केवल मेथिलीकृत DNA काटता है, उत्परिवर्ती छोड़ते हुए। CRISPR–Cas9 क्रमादेश्य जीनोम संपादन है: एक गाइड RNA किसी 20-nt लक्ष्य से क्षार-युग्मित होता है जिसे एक लघु PAM अनुक्रम के पास होना चाहिए, और Cas9 न्यूक्लिएज़ वहाँ एक द्विरज्जुक विच्छेद बनाता है। कोशिका उसकी मरम्मत असमजात सिरा जुड़ाव (NHEJ) से करती है, जो त्रुटि-प्रवण है और अतः छोटे इंडेल से किसी जीन को नॉक-आउट करती है, या, यदि कोई दाता टेम्पलेट दिया जाए, समजातता-निर्देशित मरम्मत (HDR) से, जो एक सटीक परिवर्तन नॉक-इन करती है। उत्प्रेरकीय रूप से मृत Cas9 (dCas9), प्रभावकों से संलयित होकर, काटे बिना संदमित, सक्रिय या क्षार संपादित करता है।

एक जैवसंवेदक एक जैविक पहचान तत्व (एंज़ाइम, प्रतिरक्षी, न्यूक्लिक अम्ल, कोशिका या ग्राही) को एक ट्रांसड्यूसर से युग्मित करता है जो बंधन या अभिक्रिया को एक मापनीय वैद्युतरासायनिक, प्रकाशीय, दाबविद्युत या तापीय संकेत में बदलता है। ग्लूकोस जैवसंवेदक — किसी इलेक्ट्रोड पर ग्लूकोस ऑक्सिडेज़ जो अभिक्रिया से धारा मापता है — पाठ्यपुस्तक उदाहरण है; प्रतिरक्षासंवेदक व DNA संवेदक वही तर्क अनुसरित करते हैं। DNA–प्रोटीन अन्योन्यक्रियाएँ वैद्युतकण गतिशीलता विस्थापन परख (EMSA/जेल शिफ़्ट) से अध्ययन की जाती हैं, जिसमें किसी लेबल्ड DNA खंड से बँधा प्रोटीन धीमे प्रवास करता है, DNase I फ़ुटप्रिंटिंग से (बँधा प्रोटीन अपने स्थल को कटाव से बचाता है) और, जीनोम-व्यापी, ChIP से (अध्याय 2)। प्रोटीन–प्रोटीन अन्योन्यक्रियाएँ यीस्ट द्वि-संकर तंत्र से (चारा व शिकार किसी अनुलेखन कारक के दो अर्धांशों से संलयित, अतः एक अन्योन्यक्रिया किसी सूचक को चालू करती है), सह-प्रतिरक्षा-अवक्षेपण, पुल-डाउन व FRET/SPR से अध्ययन की जाती हैं। जीनोमी व प्रोटीनोमी-आधारित उपागम — जीनों या प्रोटीनों के समस्त समुच्चय को एक साथ पढ़ना — अध्याय 2 में विकसित हैं।

⚠️ NHEJ नॉक-आउट करता है, HDR नॉक-इन करता है
किसी Cas9 कटाव के बाद, कौन-सा मरम्मत पथ कार्य करता है यह परिणाम तय करता है: NHEJ सिरों को छोटे प्रवेशों या विलोपनों सहित पुनर्जोड़ता है जो पठन-खाका खिसकाकर जीन को बाधित (नॉक-आउट) करते हैं; HDR किसी दिए दाता टेम्पलेट से एक सटीक अनुक्रम प्रतिलिपि करता है (नॉक-इन)। जो प्रश्न दाता टेम्पलेट देता है वह HDR का है; जो नहीं देता वह NHEJ-चालित नॉकआउट का।

मुख्य बिंदु

  • प्रकार II प्रतिबंधन एंज़ाइम पैलिंड्रोमी स्थल काटकर चिपचिपे या कुंठित सिरे छोड़ते हैं; T4 लाइगेज़ उन्हें जोड़ता है, और वाहक को विफ़ॉस्फ़ोरिलीकृत करना स्व-बंधन दबाता है। चिपचिपे सिरे दक्ष, दिशात्मक क्लोनन देते हैं।
  • वाहक प्रवेशक आकार से मापित होते हैं: नीला–श्वेत जाँच सहित प्लाज़्मिड (~10 kb), फ़ेज (~9–23 kb), कॉस्मिड (~45 kb), BAC (~100–300 kb), YAC (मेगाबेस)। एक अभिव्यक्ति वाहक एक प्रमोटर, RBS, समापक व प्रायः एक टैग जोड़ता है।
  • एक cDNA पुस्तकालय (mRNA से) केवल एक्सॉन रखता है और जीवाणुओं में सुकेंद्रकी जीन अभिव्यक्त करने हेतु प्रयुक्त होता है; पुस्तकालय आच्छादन N = ln(1 − P)/ln(1 − f) का अनुसरण करता है। गिब्सन व Gateway प्रतिबंधन-स्थल-स्वतंत्र संयोजन देते हैं।
  • PCR किसी प्राइमर-सीमित लक्ष्य को n चक्रों में 2^n से प्रवर्धित करता है; RT-PCR, RNA से आरंभ होता है और qPCR, Ct से मात्रा बताता है। सैंगर शृंखला-समापक ddNTP प्रयुक्त करता है; NGS लाखों खंड समानांतर अनुक्रमित करता है।
  • सदर्न DNA, नॉर्दर्न RNA (वेस्टर्न प्रोटीन) ब्लॉट करता है; RFLP सदर्न द्वारा स्थल/लंबाई परिवर्तन पढ़ता है, RAPD स्वेच्छ प्राइमर प्रयुक्त करता है। CRISPR–Cas9 किसी gRNA लक्ष्य पर PAM के पास काटता है; NHEJ नॉक-आउट करता है, दाता सहित HDR नॉक-इन करता है।

अभ्यास प्रश्न (16)

उत्तर खोलने से पहले प्रत्येक प्रश्न हल करें। हर व्याख्या सही विकल्प के साथ लुभावना गलत विकल्प भी बताती है, क्योंकि अंक वहीं जाते हैं।

  1. एक प्रकार II प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज़ क्लोनन हेतु विशेष उपयोगी है क्योंकि वह

    1. किसी विशिष्ट, परिभाषित पहचान स्थल पर या उसके अति निकट काटता है
    2. DNA को यादृच्छिक स्थानों पर काटता है
    3. अपने पहचान स्थल से दूर काटता है
    4. काटने हेतु ATP व S-ऐडेनोसिलमेथायोनीन माँगता है
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — किसी विशिष्ट, परिभाषित पहचान स्थल पर या उसके अति निकट काटता है

    प्रकार II एंज़ाइम किसी परिभाषित, प्रायः पैलिंड्रोमी स्थल पर या ठीक उसके पास काटते हैं और केवल Mg²⁺ माँगते हैं, अतः वे जो खंड बनाते हैं वे पुनरुत्पाद्य व परिभाषित होते हैं — ठीक वही जो क्लोनन को चाहिए। प्रकार I व III एंज़ाइम अपने स्थल से दूर काटते हैं (और ATP व अन्य सहकारक माँगते हैं), अप्रत्याशित खंड देते हुए।

  2. एक आदर्श PCR में एक अकेला द्विरज्जुकी लक्ष्य अणु दक्षता 1 के साथ 20 चक्रों तक प्रवर्धित होता है। लक्ष्य अणुओं की संख्या ______ है (2 की 20 घात का मान दें)।

    संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।

    उत्तर देखें

    उत्तर: 1048576

    प्रत्येक चक्र लक्ष्य को दुगुना करता है, अतः n चक्रों के बाद एक अणु 2^n हो जाता है। n = 20 हेतु यह 2^20 = 1 048 576 है। (वास्तविक PCR में केवल दोनों प्राइमरों से घिरा विशिष्ट उत्पाद पहले कुछ चक्रों के बाद 2^n के रूप में संचित होता है, और दक्षता 1 से कम होती है।)

  3. X-gal पर pUC-आधारित नीला–श्वेत जाँच में, पॉलीलिंकर में प्रवेशक सहित प्लाज़्मिड वहन करने वाला एक जीवाणु उपनिवेश दिखता है

    1. श्वेत, क्योंकि प्रवेशक lacZ-अल्फ़ा खंड को बाधित करता है और कोई क्रियाशील बीटा-गैलैक्टोसिडेज़ नहीं बनता
    2. नीला, क्योंकि प्रवेशक बीटा-गैलैक्टोसिडेज़ सक्रिय करता है
    3. लाल, किसी लौह अभिक्रिया से
    4. रंगहीन क्योंकि वह मर जाता है
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — श्वेत, क्योंकि प्रवेशक lacZ-अल्फ़ा खंड को बाधित करता है और कोई क्रियाशील बीटा-गैलैक्टोसिडेज़ नहीं बनता

    पॉलीलिंकर में कोई प्रवेशक lacZ-अल्फ़ा कूटन अनुक्रम को बाधित करता है, अतः पूरण विफल होता है, कोई सक्रिय बीटा-गैलैक्टोसिडेज़ नहीं बनता, और X-gal नीले उत्पाद में नहीं कटता — एक श्वेत उपनिवेश। रिक्त वाहक lacZ-अल्फ़ा अक्षत रखता है और नीला हो जाता है। श्वेत उपनिवेश ही चुनने योग्य पुनर्योगज हैं।

  4. एक मानव प्रोटीन को E. coli में उत्पन्न किया जाना है। कूटन अनुक्रम सबसे अच्छा किस रूप में प्राप्त होता है?

    1. उसके mRNA के प्रतीप-अनुलेखन से बना cDNA, क्योंकि उसमें इंट्रॉन नहीं होते
    2. सभी इंट्रॉन सहित एक जीनोमी क्लोन
    3. यादृच्छिक अपरूपित जीनोमी खंड
    4. एक RAPD उत्पाद
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — उसके mRNA के प्रतीप-अनुलेखन से बना cDNA, क्योंकि उसमें इंट्रॉन नहीं होते

    E. coli स्प्लाइस नहीं कर सकता, अतः इंट्रॉन सहित जीनोमी क्लोन सही प्रोटीन नहीं देगा। परिपक्व mRNA से प्रतीप-अनुलेखित cDNA में केवल एक्सॉन होते हैं और अतः वह निरंतर कूटन अनुक्रम कूटित करता है जिसे जीवाणु सीधे अनुवादित कर सके।

  5. PCR चक्र के तीन चरणों — विकृतन, तापानुशीतन व विस्तारण — में तापानुशीतन ताप किस प्रकार चुना जाता है?

    1. प्राइमरों के गलनांक से कुछ डिग्री नीचे
    2. विकृतन ताप से ऊपर
    3. 72 °C पर, पॉलिमरेज़ इष्टतम पर
    4. 0 °C पर एंज़ाइम को बचाने हेतु
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — प्राइमरों के गलनांक से कुछ डिग्री नीचे

    तापानुशीतन प्राइमरों के Tm से ठीक नीचे रखा जाता है ताकि वे अपने पूरक लक्ष्य से विशिष्ट रूप से बँधें; बहुत कम ताप उन्हें असुमेलित स्थलों से बँधने और अविशिष्ट उत्पाद बनाने देता है। 72 °C विस्तारण चरण है और विकृतन लगभग 95 °C।

  6. सैंगर डाइडीऑक्सी अनुक्रमण इसलिए काम करता है कि एक डाइडीऑक्सीन्यूक्लिओटाइड, एक बार समाविष्ट होने पर,

    1. अगला फ़ॉस्फ़ोडाइएस्टर बंध नहीं बना सकता, क्योंकि उसमें 3-प्राइम हाइड्रॉक्सिल नहीं होता
    2. अपने पूरक क्षार से युग्मित नहीं हो सकता
    3. टेम्पलेट रज्जुक का अपघटन करता है
    4. एक बार में दो क्षार जोड़ता है
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — अगला फ़ॉस्फ़ोडाइएस्टर बंध नहीं बना सकता, क्योंकि उसमें 3-प्राइम हाइड्रॉक्सिल नहीं होता

    एक ddNTP सामान्यतः क्षार-युग्मित होता है पर उसमें 3-प्राइम हाइड्रॉक्सिल नहीं होता, अतः कोई और न्यूक्लिओटाइड नहीं जुड़ सकता और संश्लेषण उस क्षार पर समाप्त होता है। हर समापन लंबाई के खंड चलाकर समापक क्षार पढ़ना अनुक्रम देता है।

  7. नॉर्दर्न ब्लॉटिंग किसलिए प्रयुक्त होती है?

    1. किसी विशिष्ट RNA का संसूचन व किसी अनुलेख का आकार व प्रचुरता मापना
    2. किसी विशिष्ट DNA खंड का संसूचन
    3. किसी विशिष्ट प्रोटीन का संसूचन
    4. DNA प्रवर्धित करना
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — किसी विशिष्ट RNA का संसूचन व किसी अनुलेख का आकार व प्रचुरता मापना

    नॉर्दर्न ब्लॉटिंग RNA को अलग कर, स्थानांतरित कर, उसे प्रोब करती है, अतः वह मापती है कि किसी जीन का अनुलेख उपस्थित है या नहीं व कितना और उसका आकार — अभिव्यक्ति का पठन। DNA सदर्न है, प्रोटीन वेस्टर्न, और प्रवर्धन PCR।

  8. किसी CRISPR–Cas9 द्विरज्जुक विच्छेद की बिना दाता टेम्पलेट के असमजात सिरा जुड़ाव (NHEJ) से मरम्मत के बाद सामान्य परिणाम है

    1. छोटे प्रवेश या विलोपन जो खाका खिसकाते और जीन को नॉक-आउट करते हैं
    2. जीन का सटीक, निशानरहित प्रतिस्थापन
    3. जीन का प्रवर्धन
    4. जीन का मेथिलीकरण
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — छोटे प्रवेश या विलोपन जो खाका खिसकाते और जीन को नॉक-आउट करते हैं

    NHEJ टूटे सिरों को अशुद्ध रूप से पुनर्जोड़ता है, छोटे इंडेल छोड़ते हुए जो प्रायः पठन-खाका खिसकाकर प्रोटीन समाप्त करते हैं — एक नॉक-आउट। सटीक परिवर्तन (नॉक-इन) को दाता टेम्पलेट व समजातता-निर्देशित मरम्मत चाहिए, जो NHEJ नहीं है।

  9. यीस्ट द्वि-संकर तंत्र किसके संसूचन हेतु प्रयुक्त होता है?

    1. प्रोटीन–प्रोटीन अन्योन्यक्रियाएँ
    2. DNA में प्रतिबंधन स्थल
    3. किसी mRNA का आकार
    4. किसी प्राइमर का गलनांक
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — प्रोटीन–प्रोटीन अन्योन्यक्रियाएँ

    द्वि-संकर तंत्र में एक चारा प्रोटीन व एक शिकार प्रोटीन किसी अनुलेखन कारक के DNA-बंधन व सक्रियण डोमेनों से संलयित किए जाते हैं; केवल यदि चारा व शिकार अन्योन्यक्रिया करें तो डोमेन साथ आकर किसी सूचक जीन को चालू करते हैं। यह प्रोटीन–प्रोटीन अन्योन्यक्रिया बताता है, DNA स्थल, RNA आकार या प्राइमर Tm नहीं।

  10. एक जीनोमी पुस्तकालय 4000 kb के जीनोम से औसत 20 kb प्रवेशक सहित बनता है। किसी भी अनुक्रम के प्रतिनिधित्व की 99% प्रायिकता हेतु आवश्यक स्वतंत्र क्लोनों की संख्या ______ है (निकटतम पूर्णांक तक; N = ln(1 − P)/ln(1 − f) प्रयोग करें)।

    संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।

    उत्तर देखें

    उत्तर: 919

    f = 20/4000 = 0.005 व P = 0.99, अतः N = ln(1 − 0.99)/ln(1 − 0.005) = ln(0.01)/ln(0.995) = (−4.6052)/(−0.0050125) = 918.7, लगभग 919। 0.995 प्रयोग करना या लघुगणक भूलना बहुत कम क्लोन देता है।

  11. निम्नलिखित में से कौन-से वाहक–क्षमता युग्म सही हैं? सभी लागू चुनें।

    1. प्लाज़्मिड — लगभग 10 kb तक
    2. कॉस्मिड — लगभग 45 kb तक
    3. BAC — लगभग 100–300 kb की कोटि
    4. प्लाज़्मिड — लगभग एक मेगाबेस की कोटि
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — प्लाज़्मिड — लगभग 10 kb तक; B — कॉस्मिड — लगभग 45 kb तक; C — BAC — लगभग 100–300 kb की कोटि

    सामान्य प्लाज़्मिड छोटे प्रवेशक (~10 kb) लेते हैं, कॉस्मिड लगभग 45 kb और BAC सैकड़ों kb; मेगाबेस प्रवेशकों को YAC चाहिए, प्लाज़्मिड नहीं, अतः प्लाज़्मिड को मेगाबेस क्षमता से जोड़ने वाला युग्म ग़लत है। क्षमता जितनी बड़ी, जीनोम को उतने कम क्लोन चाहिए।

  12. किसी प्रवेशक को बंधित करने से पहले एक रैखिकीकृत प्लाज़्मिड वाहक को क्षारीय फ़ॉस्फ़ेटेज़ से उपचारित किया जाता है। इसका उद्देश्य है

    1. वाहक के 5-प्राइम फ़ॉस्फ़ेट हटाना ताकि वह बिना प्रवेशक के स्वयं से पुनर्बंधित न हो सके
    2. फ़ॉस्फ़ेट जोड़ना ताकि वाहक तेज़ी से बंधे
    3. वाहक को बचाने हेतु उसका मेथिलीकरण
    4. सिरों को कुंठित बनाना
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — वाहक के 5-प्राइम फ़ॉस्फ़ेट हटाना ताकि वह बिना प्रवेशक के स्वयं से पुनर्बंधित न हो सके

    लाइगेज़ को फ़ॉस्फ़ोडाइएस्टर बंध बनाने हेतु एक 5-प्राइम फ़ॉस्फ़ेट चाहिए। वाहक के 5-प्राइम फ़ॉस्फ़ेट हटाने का अर्थ है कि वाहक के दो सिरे एक-दूसरे से नहीं जुड़ सकते, अतः वाहक केवल प्रवेशक के फ़ॉस्फ़ेट प्रयोग कर बंद हो सकता है — जो रिक्त स्व-बंधित पृष्ठभूमि दबाता है। यह कुंठित, मेथिलीकृत या फ़ॉस्फ़ेट-योजित नहीं करता।

  13. वास्तविक-काल मात्रात्मक PCR में, अधिक आरंभिक टेम्पलेट वाला प्रतिदर्श एक देहली चक्र (Ct) देता है जो

    1. कम, क्योंकि प्रतिदीप्ति कम चक्रों के बाद देहली पार करती है
    2. अधिक, क्योंकि अधिक टेम्पलेट को अधिक चक्र चाहिए
    3. अपरिवर्तित, क्योंकि Ct टेम्पलेट से स्वतंत्र है
    4. ऋणात्मक
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — कम, क्योंकि प्रतिदीप्ति कम चक्रों के बाद देहली पार करती है

    अधिक आरंभिक टेम्पलेट संसूचन देहली शीघ्र पहुँचता है, अतः उसका Ct कम होता है; निवेश के प्रत्येक द्विगुणन हेतु Ct लगभग एक चक्र घटता है। उच्चतर Ct का अर्थ कम आरंभिक सामग्री। यही व्युत्क्रम संबंध qPCR को किसी प्रतिदर्श की मात्रा बताने देता है।

  14. DNA फ़िंगरप्रिंटिंग हेतु RFLP व RAPD की तुलना करने वाले कौन-से कथन सही हैं? सभी लागू चुनें।

    1. RFLP अत्यधिक पुनरुत्पाद्य व सहप्रभावी है पर श्रमसाध्य और अच्छी गुणवत्ता का DNA माँगता है
    2. RAPD स्वेच्छ अनुक्रम के एकल लघु प्राइमर प्रयुक्त करता है और कोई पूर्व अनुक्रम जानकारी नहीं माँगता
    3. RAPD एक प्रभावी चिह्नक है और अभिक्रिया दशाओं के प्रति अधिक संवेदी
    4. RFLP को स्वेच्छ प्राइमरों सहित PCR चाहिए
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — RFLP अत्यधिक पुनरुत्पाद्य व सहप्रभावी है पर श्रमसाध्य और अच्छी गुणवत्ता का DNA माँगता है; B — RAPD स्वेच्छ अनुक्रम के एकल लघु प्राइमर प्रयुक्त करता है और कोई पूर्व अनुक्रम जानकारी नहीं माँगता; C — RAPD एक प्रभावी चिह्नक है और अभिक्रिया दशाओं के प्रति अधिक संवेदी

    RFLP पुनरुत्पाद्य, सहप्रभावी व सदर्न-ब्लॉट-आधारित है (कोई स्वेच्छ-प्राइमर PCR नहीं); RAPD एकल स्वेच्छ प्राइमर प्रयुक्त करता है, कोई अनुक्रम जानकारी नहीं माँगता, और प्रभावी व दशा-संवेदी है। यह कथन कि RFLP को स्वेच्छ प्राइमरों सहित PCR चाहिए, RAPD की स्वेच्छ-प्राइमर PCR को ग़लत रूप से RFLP को सौंपता है।

  15. एक आधुनिक पूर्ण-प्लाज़्मिड स्थल-निर्देशित उत्परिवर्तजनन किट में, उत्परिवर्तजनक प्राइमरों से प्लाज़्मिड प्रवर्धित करने के बाद अभिक्रिया को DpnI से उपचारित किया जाता है। DpnI इसलिए प्रयुक्त होता है कि वह

    1. केवल मेथिलीकृत DNA काटता है, अतः वह जनक टेम्पलेट नष्ट करता है पर नव-संश्लेषित उत्परिवर्ती नहीं
    2. केवल उत्परिवर्ती रज्जुक काटता है
    3. उत्परिवर्तन जोड़ता है
    4. खाँचेदार उत्पाद को बंधित करता है
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — केवल मेथिलीकृत DNA काटता है, अतः वह जनक टेम्पलेट नष्ट करता है पर नव-संश्लेषित उत्परिवर्ती नहीं

    जनक प्लाज़्मिड E. coli में उगा था और अतः Dam-मेथिलीकृत है, जबकि उत्परिवर्तजनक प्राइमरों से इन विट्रो संश्लेषित प्लाज़्मिड नहीं। DpnI केवल मेथिलीकृत (व अर्ध-मेथिलीकृत) DNA काटता है, अतः वह चयनात्मक रूप से टेम्पलेट नष्ट करता है और अमेथिलीकृत उत्परिवर्ती को पुनःप्राप्ति हेतु छोड़ता है।

  16. गिब्सन संयोजन व Gateway क्लोनन मुख्यतः किसलिए मूल्यवान हैं?

    1. अद्वितीय प्रतिबंधन स्थलों पर निर्भर हुए बिना DNA जोड़ या चला सकते हैं
    2. किसी DNA की आवश्यकता नहीं रखते
    3. DNA को सीधे अनुक्रमित करते हैं
    4. परपोषी कोशिका को प्रतिस्थापित करते हैं
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — अद्वितीय प्रतिबंधन स्थलों पर निर्भर हुए बिना DNA जोड़ या चला सकते हैं

    दोनों पुनर्योजन- या अतिव्यापन-आधारित विधियाँ हैं जो सुविधाजनक अद्वितीय प्रतिबंधन स्थलों की आवश्यकता के बिना संरचनाएँ संयोजित करती हैं — गिब्सन अतिव्यापी खंडों को एक समतापीय अभिक्रिया में जोड़ता है, Gateway फ़ेज att-स्थल पुनर्योजन प्रयुक्त करता है। यही निर्बाध, निशानरहित, बहु-खंड निर्माण को नियमित बनाता है।