प्राणी व सूक्ष्मजीवी जैवप्रौद्योगिकी — कोशिका संवर्धन, हाइब्रिडोमा व मूल कोशिकाएँ, पारजीनी प्राणी, तथा औद्योगिक सूक्ष्मजीव

खंड 5 का दूसरा अध्याय पाठ्यक्रम के शेष दो उपशीर्षक लेता है: प्राणी व सूक्ष्मजीव। पहले प्राणी कोशिका प्रौद्योगिकी — संवर्धन माध्यम व वृद्धि दशाएँ, कोशिकाओं व ऊतक का परिरक्षण, आसंजन-निर्भर बनाम निलंबन संवर्धन, प्राणी कोशिका वृद्धि की बलगतिकी, तथा वे सूक्ष्म- व बृहत्-वाहक जो आसंजन-निर्भर कोशिकाओं को बड़े पैमाने पर उगाने देते हैं। फिर वे कोशिकाएँ व प्राणी जिन्हें जैवप्रौद्योगिकी उनसे बनाती है: एकल-क्लोनी प्रतिरक्षियों हेतु हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी, मूल कोशिका प्रौद्योगिकी, प्राणी क्लोनन, पारजीनी प्राणी, तथा नॉक-आउट व नॉक-इन प्राणी। अंत में सूक्ष्मजीवी जैवप्रौद्योगिकी — जैवभार तथा प्राथमिक व द्वितीयक उपापचयजों (जैवईंधन, जैवप्लास्टिक, औद्योगिक एंज़ाइम, प्रतिजैविक) का उत्पादन, पुनर्योगज प्रोटीनों का वृहत्-पैमाने पर उत्पादन व शोधन, नैदानिक, खाद्य व औद्योगिक सूक्ष्मजीवविज्ञान, तथा नए उत्पादों की जाँच हेतु प्रयुक्त रणनीतियाँ।

1. प्राणी कोशिका संवर्धन — माध्यम, वृद्धि दशाएँ व परिरक्षण

प्राणी कोशिकाएँ सूक्ष्मजीवों या पादप कोशिकाओं से अधिक माँगपूर्ण हैं। DMEM (डल्बेको संशोधित ईगल माध्यम) जैसे मानक आधार माध्यम ग्लूकोस, ऐमीनो अम्ल (ग्लूटामीन सहित, एक मुख्य कार्बन व नाइट्रोजन स्रोत), विटामिन व अकार्बनिक लवण देते हैं, और प्रायः वृद्धि कारकों, हार्मोनों, आसंजन व वाहक प्रोटीनों तथा प्रोटिएज़ संदमकों हेतु 5–10% भ्रूणीय गोजातीय सीरम (FBS) से संपूरित किए जाते हैं। सीरम परिवर्ती व महँगा है, अतः सीरम-मुक्त व रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम बढ़ते प्रयुक्त होते हैं, विशेषकर चिकित्सीय उत्पादन हेतु जहाँ परिभाषित संघटन व प्राणी संदूषकों से मुक्ति महत्त्वपूर्ण है। माध्यम फेनॉल रेड को pH सूचक रखते हुए एक CO₂/बाइकार्बोनेट बफ़र रखता है, और संवर्धन लगभग pH 7.2–7.4 बनाए रखने हेतु 37 °C पर आर्द्रीकृत 5% CO₂ इनक्यूबेटर में रखे जाते हैं। संदूषण के विरुद्ध पेनिसिलिन–स्ट्रेप्टोमाइसिन जैसे प्रतिजैविक मिलाए जाते हैं, जिसके प्रति प्राणी संवर्धन अत्यधिक सुभेद्य हैं क्योंकि वे धीमे बढ़ते हैं।

एक प्राथमिक संवर्धन सीधे किसी ऊतक से बनता है (प्रायः ट्रिप्सिन व EDTA से विघटित); एक बार उप-संवर्धित होने पर वह कोशिका वंश बन जाता है। एक परिमित कोशिका वंश सीमित बार विभाजित होकर फिर प्रतिकृतीय जीर्णता से रुक जाता है (हेफ़्लिक सीमा), जबकि एक सतत (अमर्त्यीकृत) वंश — HeLa, CHO, HEK-293 — रूपांतरण या अमर्त्यीकरण के बाद अनिश्चित काल तक विभाजित होता है। परिरक्षण परिशीतन-संरक्षण से होता है: कोशिकाओं को एक परिशीतन-रक्षक, प्रायः 5–10% DMSO या ग्लिसरॉल, युक्त माध्यम में धीरे (लगभग 1 °C प्रति मिनट) जमाया जाता है ताकि बर्फ़ के क्रिस्टल कोशिकाओं को न फाड़ें, लगभग −196 °C पर द्रव नाइट्रोजन में भंडारित किया जाता है, और तेज़ी से पिघलाया जाता है। परिशीतन-रक्षक हिमांक घटाता है और अंतःकोशिकीय बर्फ़ कम करता है; धीमा शीतलन कोशिका के भीतर जमने से पहले जल को परासरणतः बाहर जाने देता है।

2. आसंजन निर्भरता, वृद्धि बलगतिकी, तथा सूक्ष्म- व बृहत्-वाहक संवर्धन

अधिकांश सामान्य प्राणी कोशिकाएँ आसंजन-निर्भर होती हैं: उन्हें बढ़ने हेतु किसी सतह पर जुड़कर फैलना पड़ता है, और सतह ढकने पर विभाजन रोक देती हैं (संपर्क संदमन)। उन्हें उपचारित प्लास्टिक (फ़्लास्क, रोलर बोतल) पर एकस्तर के रूप में उगाया जाता है और ट्रिप्सिन से अलग कर उप-संवर्धित किया जाता है। रूपांतरित व अनेक अर्बुद कोशिकाएँ आसंजन-स्वतंत्र होती हैं और निलंबन में बढ़ती हैं, जिसे बड़ा करना कहीं सरल है; हाइब्रिडोमा व अभियांत्रिकीकृत CHO वंश प्रायः इसी कारण निलंबन हेतु अनुकूलित किए जाते हैं। एक बैच में वृद्धि पश्चता, घातांकी (लॉग) व पठार प्रावस्थाओं का अनुसरण करती है, और घातांकी प्रावस्था में जनसंख्या द्विगुणन समय td = ln 2/mu, mu = ln(N₂/N₁)/(t₂ − t₁) है; प्राणी कोशिका द्विगुणन समय लंबे होते हैं, प्रायः लगभग एक दिन। जीवनक्षमता व संख्या हीमोसाइटोमीटर व ट्रिपैन ब्लू से पढ़ी जाती है, जो केवल मृत कोशिकाओं को अभिरंजित करता है क्योंकि उनकी झिल्लियों ने अखंडता खो दी है।

आसंजन निर्भरता जो समस्या रचती है वह सतह क्षेत्रफल है: एकस्तर प्रति इकाई आयतन कम क्षेत्रफल देता है, अतः मापक्रम-वृद्धि का अर्थ अधिक सतह है, केवल अधिक माध्यम नहीं। सूक्ष्मवाहक इसे हल करते हैं — डेक्स्ट्रान, जिलेटिन या प्लास्टिक के छोटे (लगभग 100–300 माइक्रोमीटर) मनके, कभी आवेशित (DEAE) या कोलैजन-लेपित, जो जैवरिएक्टर में निलंबित व कोमलता से विलोड़ित किए जाते हैं ताकि आसंजन-निर्भर कोशिकाएँ उनकी सतह पर बढ़ें। चूँकि प्रति मनका सतह क्षेत्रफल उसके व्यास के वर्ग के साथ बढ़ता है जबकि प्रति इकाई आयतन मनकों की संख्या व्यास के घन के व्युत्क्रम (1/d³) के साथ, इसलिए प्रति इकाई आयतन कुल क्षेत्रफल 1/d के साथ बढ़ता है, और छोटे मनकों का कोई दिया द्रव्यमान बहुत बड़ा कुल क्षेत्रफल देता है: सूक्ष्मवाहक एक सतह समस्या को विलोड़ित-टैंक समस्या में बदल देते हैं। बृहत्सछिद्र वाहक और आगे जाते हैं, जिनमें कोशिकाएँ भीतर बढ़ती हैं, जो उन्हें अपरूपण से भी बचाता है और बहुत उच्च घनत्व देता है; संकुलित-संस्तर व तरलीकृत-संस्तर रिएक्टर अभिस्रवण संवर्धन हेतु ऐसे वाहक प्रयुक्त करते हैं। खोखला-तंतु रिएक्टर कोशिकाओं को अर्धपारगम्य तंतुओं के बाहर उगाते हैं जिनसे माध्यम बहता है, ऊतक-सम घनत्व तक पहुँचते हुए।

🎯 छोटे मनके अधिक क्षेत्रफल क्यों देते हैं
एक निश्चित कुल मनका द्रव्यमान (निश्चित कुल आयतन) हेतु, मनका व्यास आधा करने से मनकों की संख्या आठ गुना हो जाती है (आयतन d³ अनुसार) जबकि प्रत्येक मनके का क्षेत्रफल केवल चार गुना घटता है (क्षेत्रफल d² अनुसार), अतः कुल सतह क्षेत्रफल दुगुना हो जाता है। अतः छोटे वाहक उसी टैंक में अधिक वृद्धि-क्षेत्रफल भरते हैं — किसी सूक्ष्मवाहक आंकिक के पीछे का सामान्य GATE तर्क।

3. हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी व मूल कोशिका प्रौद्योगिकी

हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी (कोह्लर व मिल्स्टाइन, 1975) एकल, परिभाषित (एकल-क्लोनी) प्रतिरक्षी बनाती है। एक चूहे को प्रतिजन से प्रतिरक्षित किया जाता है; उसकी प्रतिरक्षी-स्रावी B कोशिकाएँ (प्लाज़्मा कोशिकाएँ) — जो अनिश्चित काल तक विभाजित नहीं हो सकतीं — PEG से एक अमर मायलोमा कोशिका वंश से संलयित की जाती हैं। संलयित कोशिकाएँ हाइब्रिडोमा चुनने हेतु HAT माध्यम (हाइपोज़ैंथीन, ऐमिनोप्टेरिन, थायमिडीन) में उगाई जाती हैं: ऐमिनोप्टेरिन नव-संश्लेषण न्यूक्लिओटाइड पथ रोकता है, अतः कोशिकाओं को उद्धार पथ प्रयोग करना पड़ता है, जिसे एंज़ाइम HGPRT चाहिए। मायलोमा साझेदार को HGPRT-न्यून चुना जाता है, अतः असंलयित मायलोमा कोशिकाएँ HAT में मर जाती हैं; असंलयित B कोशिकाएँ अपने परिमित जीवनकाल से मरती हैं; केवल एक B कोशिका × मायलोमा हाइब्रिडोमा में B कोशिका का HGPRT (HAT में जीवित) और मायलोमा की अमरता (सदा विभाजित) दोनों होते हैं। फिर हाइब्रिडोमा जाँचे जाते हैं (ELISA से), धनात्मक को सीमित तनुकरण से क्लोनित किया जाता है, और प्रत्येक क्लोन एक प्रतिरक्षी स्रावित करता है। चिकित्सीय प्रतिरक्षी चूहे के प्रतिरक्षी द्वारा उकसाई प्रतिरक्षा अनुक्रिया से बचने हेतु मानवीकृत या पूर्णतः मानव बनाए जाते हैं (काइमेरिक संरचनाओं, पारजीनी चूहों या फ़ेज प्रदर्शन से)।

मूल कोशिकाएँ अविशिष्ट कोशिकाएँ हैं जो स्व-नवीनीकरण करती हैं और विभेदित हो सकती हैं। उन्हें शक्ति से श्रेणीबद्ध किया जाता है: एक पूर्णशक्त युग्मनज पूरे जीव व अपरा को बना सकता है; बहुशक्त भ्रूणीय मूल (ES) कोशिकाएँ, कोरकपुटी के अंतर्कोशिका पिंड से, शरीर की कोई भी कोशिका बना सकती हैं पर अपरा नहीं; अनेकशक्त वयस्क मूल कोशिकाएँ (जैसे रक्तजनक या मध्योतकी मूल कोशिकाएँ) किसी वंशक्रम के भीतर सीमित परास बनाती हैं; और एकशक्त कोशिकाएँ एक प्रकार बनाती हैं। प्रेरित बहुशक्त मूल (iPS) कोशिकाएँ — ताकाहाशी व यामानाका, 2006 — वयस्क कायिक कोशिकाएँ हैं जो अनुलेखन कारकों के एक छोटे समुच्चय (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) को बाध्य कर बहुशक्तता तक पुनर्क्रमादेशित की जाती हैं, जो भ्रूणों की नैतिक समस्याओं को दरकिनार करता है और रोगी-सुमेलित कोशिकाएँ देता है। मूल कोशिकाएँ पुनर्योजी चिकित्सा (अस्थि-मज्जा प्रत्यारोपण स्थापित उदाहरण है), रोग प्रतिरूपण व औषधि परीक्षण में प्रयुक्त होती हैं।

⚠️ पादपों में पूर्णशक्त, ES कोशिकाओं में बहुशक्त
पादप कोशिकाएँ पूर्णशक्त कही जाती हैं क्योंकि कायिक कोशिका पूरे पौधे को पुनः उगाती है (अध्याय 1)। प्राणियों में भ्रूणीय मूल कोशिकाएँ बहुशक्त हैं, पूर्णशक्त नहीं — वे शरीर बनाती हैं पर अपरा नहीं — और केवल युग्मनज व उसके आरंभिकतम कोरकखंड सचमुच पूर्णशक्त हैं। दोनों शब्द प्रयोग करने वाला प्रश्न इसी भेद की परीक्षा लेता है।

4. प्राणी क्लोनन, पारजीनी प्राणी, तथा नॉक-आउट व नॉक-इन प्राणी

कायिक कोशिका केंद्रक स्थानांतरण (SCNT) द्वारा प्राणी क्लोनन एक कायिक (शरीर) कोशिका का केंद्रक लेकर एक अकेंद्रकित अंडे (जिसका अपना केंद्रक हटा दिया गया अंडाणु) में अंतःक्षेपित करता है; पुनर्रचित अंडा सक्रिय किया जाता है, भ्रूण में विकसित होता है और एक सरोगेट में आरोपित किया जाता है। मेमना डॉली (1996) किसी वयस्क कायिक कोशिका से क्लोनित पहला स्तनधारी था, जिसने सिद्ध किया कि एक विभेदित केंद्रक अंडे के कोशिकाद्रव्य द्वारा पूर्णशक्तता तक पुनर्क्रमादेशित हो सकता है। क्लोन के केंद्रकीय जीन केंद्रक के दाता से आते हैं, पर उसके माइटोकॉन्ड्रिया ग्राही अंडे से आते हैं, अतः वह पूर्ण आनुवंशिक प्रतिलिपि नहीं है। SCNT विशिष्ट पशुधन को गुणित करने और, चिकित्सीय क्लोनन के रूप में, रोगी-सुमेलित ES कोशिकाएँ व्युत्पन्न करने में प्रयुक्त होता है।

पारजीनी प्राणी जानबूझकर जोड़ा गया पराया जीन वहन करते हैं। क्लासिक मार्ग पूर्वकेंद्रकीय सूक्ष्मअंतःक्षेपण है — DNA को निषेचित अंडे के नर पूर्वकेंद्रक में अंतःक्षेपित किया जाता है और वह यादृच्छिक रूप से समाकलित होता है; अन्य हैं रेट्रोवायरल या लेंटिवायरल संक्रमण, तथा ES-कोशिका-आधारित विधियाँ। उपयोगों में जीन फ़ार्मिंग (दूध में चिकित्सीय प्रोटीन बनाना — पारजीनी बकरियों से ऐंटीथ्रॉम्बिन अनुमोदित होने वाला पहला ऐसा उत्पाद था), रोग प्रतिरूप, तथा तेज़ी से बढ़ते या रोग-प्रतिरोधी पशुधन सम्मिलित हैं। नॉक-आउट व नॉक-इन प्राणी जीन लक्ष्यन से बनते हैं: लक्ष्य जीन से समजात क्षेत्रों वाली एक संरचना ES कोशिकाओं में डाली जाती है, और किसी विरल कोशिका में वह सही स्थल पर समजात पुनर्योजन से समाकलित होती है। नॉक-आउट जीन को बाधित करता है (उसे हटाकर यह पता लगाने हेतु कि वह क्या करता है); नॉक-इन उसे किसी संशोधित या सूचक संस्करण से प्रतिस्थापित करता है, या किसी परिभाषित स्थल पर अनुक्रम डालता है। चयनित ES कोशिकाएँ एक कोरकपुटी में अंतःक्षेपित कर काइमेरा बनाई जाती हैं, जिसे जनन-रेखा से परिवर्तन पाने हेतु प्रजनित किया जाता है। सप्रतिबंध नॉक-आउट Cre–lox तंत्र प्रयुक्त करते हैं — loxP स्थल लक्ष्य को घेरते हैं, और केवल किसी चुने ऊतक या समय में अभिव्यक्त Cre रिकॉम्बिनेज़ उसे वहाँ विलोपित करता है — अतः विकास हेतु अनिवार्य जीन का भी वयस्क में अध्ययन हो सकता है। CRISPR–Cas9 (आणविक उपकरण अध्याय) अब इन सबको कहीं तेज़ बनाता है और ES कोशिकाएँ नहीं माँगता।

⚠️ यादृच्छिक समाकलन बनाम जीन लक्ष्यन
पूर्वकेंद्रकीय सूक्ष्मअंतःक्षेपण से बना “पारजीनी” प्राणी पारजीन को किसी यादृच्छिक स्थल पर, प्रायः कई प्रतियों में, डाला रखता है। “नॉक-आउट/नॉक-इन” किसी परिभाषित स्थल पर समजात पुनर्योजन से आता है, अतः स्थिति नियंत्रित होती है। जो प्रश्न समजात भुजाओं, किसी विशिष्ट स्थल या Cre–lox पर बल दे, वह लक्ष्यन का है, यादृच्छिक पारजीनन का नहीं।

5. सूक्ष्मजीवी जैवप्रौद्योगिकी — जैवभार व उपापचयज

सूक्ष्मजीव जैवभार स्वयं हेतु और उपापचयजों हेतु उगाए जाते हैं। प्राथमिक उपापचयज वृद्धि के दौरान बनते हैं और प्रायः वृद्धि-संबद्ध होते हैं — एथेनॉल व लैक्टिक अम्ल (किण्वन), ग्लूटामेट व लाइसीन जैसे ऐमीनो अम्ल, सिट्रिक अम्ल जैसे कार्बनिक अम्ल (ऐस्पर्जिलस नाइजर), तथा विटामिन। द्वितीयक उपापचयज प्रायः वृद्धि धीमी होने के बाद (इडियोफ़ेज) बनते हैं और वृद्धि हेतु आवश्यक नहीं — प्रतिजैविक (पेनिसिलियम से पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसीज़ से स्ट्रेप्टोमाइसिन), तथा अनेक वर्णक व विष। जैवभार उत्पादों में एककोशिका प्रोटीन तथा बेकर व ब्रूअर यीस्ट सम्मिलित हैं। ल्यूडेकिंग–पिरेट संबंध दोनों प्रकारों को अलग करता है: विशिष्ट उत्पाद निर्माण qp = alpha·mu + beta, जहाँ वृद्धि-संबद्ध उत्पाद में beta शून्य के निकट और वृद्धि-असंबद्ध में alpha शून्य के निकट होता है।

सूक्ष्मजीव औद्योगिक पैमाने पर क्या बनाते हैं
उत्पाद समूहउदाहरणविशिष्ट जीव
जैवईंधनजैवएथेनॉल (शर्करा या स्टार्च से), जैवब्यूटेनॉल, जैवगैस (मीथेन)सैकरोमाइसीज़ सेरेविसी; क्लॉस्ट्रिडियम; मिश्रित अवायवीय
जैवप्लास्टिककार्बन/ऊर्जा कणिकाओं के रूप में संचित पॉलिहाइड्रॉक्सीब्यूटिरेट (PHB) व अन्य पॉलिहाइड्रॉक्सीऐल्केनोएटक्यूप्रियाविडस नेकेटर (रैल्स्टोनिया यूट्रोफ़ा)
औद्योगिक एंज़ाइमऐमाइलेज़, प्रोटिएज़ (अपमार्जक), सेल्युलेज़, लाइपेज़, रेनेटबैसिलस प्रजातियाँ; ऐस्पर्जिलस; अभियांत्रिकीकृत परपोषी
प्रतिजैविकपेनिसिलिन, सेफ़ैलोस्पोरिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन, टेट्रासाइक्लिन, इरिथ्रोमाइसिनपेनिसिलियम, स्ट्रेप्टोमाइसीज़, अन्य ऐक्टिनोमाइसीटी

उपज व उत्पादकता इन प्रक्रमों की अभियांत्रिकी भाषा हैं (पेपर का खंड 4 बलगतिकी विकसित करता है)। अधःस्तर पर जैवभार लब्धि Y_x/s = खपत अधःस्तर प्रति बना जैवभार है, और उत्पाद लब्धि Y_p/s अधःस्तर प्रति उत्पाद; आयतनिक उत्पादकता प्रति इकाई आयतन प्रति इकाई समय बना उत्पाद (या जैवभार) है। हल किया उदाहरण: एक किण्वन प्रति लीटर 50 g ग्लूकोस खपता है और प्रति लीटर 20 g एथेनॉल व 2 g कोशिकाएँ बनाता है। तब Y_p/s = 20/50 = 0.40 g प्रति g (प्रति g ग्लूकोस 0.51 g एथेनॉल के सैद्धांतिक अधिकतम के सापेक्ष, अतः किण्वन दक्षता 0.40/0.51 = 78%) और Y_x/s = 2/50 = 0.04 g प्रति g। यदि इसमें 10 घंटे लगें, तो एथेनॉल उत्पादकता 20/10 = 2.0 g प्रति लीटर प्रति घंटा है।

6. पुनर्योगज प्रोटीन, अनुप्रयुक्त सूक्ष्मजीवविज्ञान व नए उत्पादों की जाँच

पुनर्योगज प्रोटीनों व उपापचयजों का वृहत्-पैमाने पर उत्पादन व शोधन। एक जीन किसी परपोषी में अभिव्यक्त किया जाता है (खंड 6 वाहकों को लेता है): *E. coli* सस्ता व तेज़ है पर ग्लाइकोसिलीकरण नहीं कर सकता और प्रायः प्रोटीन को अंतर्वेश पिंडों में जमा करता है जिन्हें विलेय कर पुनर्वलित करना पड़ता है; यीस्ट (सैकरोमाइसीज़, पिचिया पैस्टोरिस) स्रावित व ग्लाइकोसिलीकृत करता है और उच्च घनत्व तक बढ़ता है; स्तनधारी कोशिकाएँ (सर्वोपरि CHO) मानव-सम ग्लाइकोसिलीकरण देती हैं और प्रतिरक्षियों व जटिल ग्लाइकोप्रोटीनों हेतु मानक हैं। उत्पादन विलोड़ित-टैंक या वेव जैवरिएक्टरों में बैच, पोषित-बैच या अभिस्रवण रीति में चलता है, pH, विलीन ऑक्सीजन, ताप व आहार नियंत्रित रखते हुए (नियंत्रण पाश खंड 4 में हैं)। डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण फिर उत्पाद पुनःप्राप्त करता है: कोशिका निष्कासन (अपकेंद्रण, निस्यंदन), अंतःकोशिकीय होने पर मुक्ति (समांगीकरण या विलयन), और शोधन — क्रम प्रायः ग्रहण, मध्यवर्ती शोधन व परिष्करण चलता है, जिसमें वर्णलेखिकी (आयन विनिमय, प्रतिरक्षियों हेतु प्रोटीन A जैसी आसक्ति, आकार बहिष्करण, जलविरागी अन्योन्यक्रिया) सूक्ष्म पृथक्करण करती है, सूत्रीकरण व निर्जर्म निस्यंदन में समाप्त होते हुए। इंसुलिन पहला पुनर्योगज चिकित्सीय प्रोटीन था (1982 में अनुमोदित)।

नैदानिक, खाद्य व औद्योगिक सूक्ष्मजीवविज्ञान। नैदानिक सूक्ष्मजीवविज्ञान रोगजनकों की पहचान कर उनकी प्रतिजैविक सुग्राह्यता परखता है और निदान व टीका उत्पादन का आधार है। खाद्य सूक्ष्मजीवविज्ञान उन दोनों सूक्ष्मजीवों को लेता है जो भोजन को ख़राब या विषाक्त करते हैं और जो उसे बनाते हैं: दही व पनीर हेतु लैक्टिक अम्ल जीवाणु, रोटी व बीयर हेतु यीस्ट, तथा प्रारंभक-संवर्धन किण्वन। औद्योगिक सूक्ष्मजीवविज्ञान ऊपर का उत्पादन पक्ष है — एंज़ाइम, अम्ल, विलायक, प्रतिजैविक, विटामिन — तथा जैवउपचार व जैवखनन।

नए उत्पादों की जाँच रणनीतियाँ। नए उत्पादक प्राथमिक जाँच से पाए जाते हैं — अनेक पृथक्कृतों पर गुणात्मक परीक्षण (मृदा प्रतिजैविक-उत्पादक ऐक्टिनोमाइसीटी का क्लासिक स्रोत है), जैसे किसी परीक्षण जीव की परत पर किसी उपनिवेश के चारों ओर संदमन क्षेत्र (संकुलित-प्लेट व अगार-आवरण विधियाँ) — फिर द्वितीयक जाँच, जो झटका-फ़्लास्क व छोटे किण्वकों में उपज, परास व नवीनता मापती है। संवर्धन समृद्धि किसी मिश्रित आरोप को रुचि के जीव की ओर उस कार्बन स्रोत, पोषक या दशा को चुनकर झुकाती है जिसे केवल वही प्रयोग करता है। उत्पादक मिलने पर उसकी उपज विभेद सुधार से बढ़ाई जाती है — उत्परिवर्तजनन व चयन के बार-बार दौर, और अब उपापचयी अभियांत्रिकी — क्योंकि जंगली पृथक्कृत उसका केवल लेश बनाता है जो औद्योगिक विभेद को बनाना होता है। आधुनिक जाँच उच्च-प्रवाह रोबोटिकी और मेटाजीनोमी पुस्तकालय जोड़ती है जो उन अनेक सूक्ष्मजीवों तक पहुँचती है जो अभी संवर्धित नहीं हो सकते।

मुख्य बिंदु

  • प्राणी कोशिकाओं को सीरम या परिभाषित संपूरकों सहित DMEM-प्रकार माध्यम, 37 °C व 5% CO₂ चाहिए; परिरक्षण 5–10% DMSO सहित धीमा हिमीकरण व द्रव नाइट्रोजन में भंडारण है।
  • आसंजन-निर्भर कोशिकाएँ एकस्तर के रूप में बढ़ती हैं और सूक्ष्मवाहकों पर मापित होती हैं (छोटे मनके प्रति आयतन अधिक क्षेत्रफल देते हैं); CHO व हाइब्रिडोमा जैसी निलंबन-अनुकूलित कोशिकाएँ कहीं सरलता से मापित होती हैं।
  • हाइब्रिडोमा B कोशिकाओं को HGPRT-न्यून मायलोमा से संलयित करते हैं और HAT में चुने जाते हैं (केवल संकर में HGPRT व अमरता दोनों); iPS कोशिकाएँ Oct4, Sox2, Klf4 व c-Myc से पुनर्क्रमादेशित होती हैं।
  • SCNT (डॉली) अकेंद्रकित अंडे में कायिक केंद्रक पुनर्क्रमादेशित करता है, अंडे के माइटोकॉन्ड्रिया रखते हुए; नॉक-आउट व नॉक-इन परिभाषित स्थल पर समजात पुनर्योजन प्रयुक्त करते हैं, Cre–lox सप्रतिबंध नियंत्रण देते हुए।
  • सूक्ष्मजीव प्राथमिक (वृद्धि-संबद्ध) व द्वितीयक (इडियोफ़ेज) उत्पाद बनाते हैं — जैवईंधन, PHB जैवप्लास्टिक, एंज़ाइम, प्रतिजैविक; पुनर्योगज प्रोटीन परपोषी चयन लागत व ग्लाइकोसिलीकरण के बीच समझौता है (E. coli < यीस्ट < CHO)।

अभ्यास प्रश्न (15)

उत्तर खोलने से पहले प्रत्येक प्रश्न हल करें। हर व्याख्या सही विकल्प के साथ लुभावना गलत विकल्प भी बताती है, क्योंकि अंक वहीं जाते हैं।

  1. हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी में संलयित कोशिकाएँ HAT माध्यम में उगाई जाती हैं। HAT में ऐमिनोप्टेरिन कोशिकाओं को न्यूक्लिओटाइड उद्धार पथ प्रयोग करने को बाध्य करता है, और जीवित हाइब्रिडोमा अपनी उत्तरजीविता किसको देते हैं?

    1. B-कोशिका साझेदार द्वारा दिया गया HGPRT, मायलोमा से अमरता सहित
    2. मायलोमा द्वारा दिया गया HGPRT, B कोशिका से अमरता सहित
    3. एक प्लाज़्मिड पर कूटित ऐमिनोप्टेरिन प्रतिरोध
    4. बिना किसी न्यूक्लिओटाइड के बढ़ने की क्षमता
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — B-कोशिका साझेदार द्वारा दिया गया HGPRT, मायलोमा से अमरता सहित

    मायलोमा को HGPRT-न्यून चुना जाता है, अतः वह उद्धार पथ प्रयोग नहीं कर सकता और नव-संश्लेषण मार्ग अवरुद्ध होने पर HAT में मर जाता है; B कोशिका क्रियाशील HGPRT देती है पर सदा विभाजित नहीं हो सकती। केवल संकर में दोनों हैं — HAT में जीने हेतु B कोशिका का HGPRT और प्रचुरोद्भवन हेतु मायलोमा की अमरता।

  2. सूक्ष्मवाहक जैवरिएक्टरों में मुख्यतः किसलिए प्रयुक्त होते हैं?

    1. एक बड़ी आसंजन सतह देने हेतु ताकि आसंजन-निर्भर कोशिकाएँ विलोड़ित निलंबन में उगाई जा सकें
    2. कोशिकाओं को सीधे ऑक्सीजन देने हेतु
    3. माध्यम से कार्बन डाइऑक्साइड हटाने हेतु
    4. नाइट्रोजन स्रोत के रूप में कार्य करने हेतु
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — एक बड़ी आसंजन सतह देने हेतु ताकि आसंजन-निर्भर कोशिकाएँ विलोड़ित निलंबन में उगाई जा सकें

    आसंजन-निर्भर कोशिकाओं को किसी सतह से जुड़ना पड़ता है, और एक सादा टैंक प्रति आयतन कम क्षेत्रफल देता है; सूक्ष्मवाहक मनके एक बड़ा कुल सतह देते हैं जो निलंबित व विलोड़ित किया जा सके, एक सतह-सीमित एकस्तर प्रक्रम को मापनीय विलोड़ित-टैंक प्रक्रम में बदलते हुए। वे ऑक्सीजन, CO₂ या नाइट्रोजन युक्ति नहीं हैं।

  3. एक बछड़ा कायिक कोशिका केंद्रक स्थानांतरण से उत्पन्न किया जाता है, गाय A से एक त्वचा-कोशिका केंद्रक और गाय B से एक अकेंद्रकित अंडा लेकर, गाय C को सरोगेट बनाते हुए। बछड़े का माइटोकॉन्ड्रियाई DNA किससे आता है?

    1. गाय B, अंडा दाता
    2. गाय A, केंद्रक दाता
    3. गाय C, सरोगेट
    4. A व C का मिश्रण
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — गाय B, अंडा दाता

    माइटोकॉन्ड्रिया कोशिकाद्रव्यी हैं, अतः वे अंडे के साथ आते हैं — गाय B, अंडा दाता, से। केंद्रकीय जीन गाय A (केंद्रक दाता) से आते हैं और सरोगेट C केवल भ्रूण को गर्भ में रखती है। इसीलिए कोई SCNT क्लोन केंद्रक दाता की पूर्ण आनुवंशिक प्रतिलिपि नहीं होता।

  4. किसी प्राणी कोशिका निलंबन की जीवनक्षम कोशिका गणना मापने हेतु कौन-सा रंजक व गणन युक्ति साथ प्रयुक्त होते हैं?

    1. ट्रिपैन ब्लू, जो केवल मृत कोशिकाओं को अभिरंजित करता है, हीमोसाइटोमीटर पर
    2. अगार प्लेट पर ग्राम अभिरंजन
    3. वैद्युतकण-संचलन जेल पर एथिडियम ब्रोमाइड
    4. स्पेक्ट्रोफ़ोटोमीटर में फेनॉल रेड
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — ट्रिपैन ब्लू, जो केवल मृत कोशिकाओं को अभिरंजित करता है, हीमोसाइटोमीटर पर

    जीवित कोशिकाएँ ट्रिपैन ब्लू को बाहर रखती हैं क्योंकि उनकी झिल्लियाँ अखंड हैं, अतः हीमोसाइटोमीटर पर नीली कोशिकाएँ मृत होती हैं और जीवनक्षम अंश कुल में अनभिरंजित गणना है। ग्राम अभिरंजन व अगार प्लेट जीवाणुओं हेतु हैं, एथिडियम ब्रोमाइड जेलों पर DNA अभिरंजित करता है, और फेनॉल रेड माध्यम का pH सूचक है।

  5. एक किण्वन प्रति लीटर 40 g ग्लूकोस खपता है और प्रति लीटर 16 g एथेनॉल उत्पन्न करता है। अधःस्तर पर एथेनॉल लब्धि Y(p/s) ______ g प्रति g है (दो दशमलव स्थान तक)।

    संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।

    उत्तर देखें

    उत्तर: 0.40

    Y(p/s) = बना एथेनॉल / खपत ग्लूकोस = 16/40 = 0.40 g प्रति g। यह प्रति g ग्लूकोस 0.51 g एथेनॉल के सैद्धांतिक अधिकतम का 0.40/0.51 = 78% है। ग्लूकोस के बजाय एथेनॉल से भाग देना, या कोशिका लब्धि प्रयोग करना, सामान्य भूलें हैं।

  6. चिकित्सीय एकल-क्लोनी प्रतिरक्षियों के उत्पादन हेतु E. coli के बजाय CHO (चाइनीज़ हैम्स्टर अंडाशय) मानक परपोषी क्यों है?

    1. CHO मानव-सम ग्लाइकोसिलीकरण करता है और सही वलित प्रतिरक्षी स्रावित करता है, जो E. coli नहीं कर सकता
    2. CHO, E. coli से तेज़ व सस्ता बढ़ता है
    3. E. coli प्लाज़्मिड प्रतिकृत नहीं कर सकता
    4. CHO को किसी जैवरिएक्टर की आवश्यकता नहीं
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — CHO मानव-सम ग्लाइकोसिलीकरण करता है और सही वलित प्रतिरक्षी स्रावित करता है, जो E. coli नहीं कर सकता

    प्रतिरक्षी ग्लाइकोप्रोटीन हैं जिनका सही कार्य व अर्ध-आयु मानव-सम ग्लाइकोसिलीकरण तथा उचित वलन व स्रावण पर निर्भर है — जो स्तनधारी CHO कोशिकाएँ करती हैं और E. coli नहीं (E. coli में ग्लाइकोसिलीकरण नहीं और प्रायः अंतर्वेश पिंड बनाता है)। E. coli वस्तुतः सस्ता व तेज़ है; वह बस किसी ग्लाइकोसिलीकृत स्रावित प्रोटीन हेतु ग़लत उपकरण है।

  7. जैवरिएक्टर में 200 माइक्रोमीटर व्यास के सूक्ष्मवाहक समान कुल संकुलित-मनका आयतन पर 100 माइक्रोमीटर व्यास के वाहकों से बदले जाते हैं। कुल उपलब्ध आसंजन सतह क्षेत्रफल किस गुणक से बढ़ता है? ______

    संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।

    उत्तर देखें

    उत्तर: 2

    गोलों हेतु, प्रति इकाई संकुलित आयतन सतह क्षेत्रफल 1/व्यास अनुसार होता है (कुल क्षेत्रफल ∝ (संख्या ∝ 1/d³) × (प्रति मनका क्षेत्रफल ∝ d²) = 1/d)। अतः व्यास 200 से 100 माइक्रोमीटर आधा करने से क्षेत्रफल दुगुना होता है, गुणक 2। क्षेत्रफल को 1/d² (जो 4 देता) मानना भूल जाता है कि मनकों की संख्या भी आयतन के साथ बदलती है।

  8. Cre–lox तंत्र प्रयोग करने वाला एक सप्रतिबंध नॉक-आउट भ्रूणीय विकास हेतु अनिवार्य किसी जीन का वयस्क में अध्ययन इसलिए होने देता है कि

    1. केवल किसी चुने ऊतक या समय में अभिव्यक्त Cre रिकॉम्बिनेज़ loxP-घिरे जीन को केवल वहीं और तभी विलोपित करता है
    2. जीन युग्मनज से आगे हर कोशिका में विलोपित होता है
    3. loxP स्थल जीन की अभिव्यक्ति बढ़ाते हैं
    4. Cre जीन को उत्परिवर्तन से बचाता है
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — केवल किसी चुने ऊतक या समय में अभिव्यक्त Cre रिकॉम्बिनेज़ loxP-घिरे जीन को केवल वहीं और तभी विलोपित करता है

    सप्रतिबंध नॉक-आउट में जीन loxP स्थलों से घिरा होता है पर Cre रिकॉम्बिनेज़ के उपस्थित होने तक क्रियाशील रहता है। Cre को किसी ऊतक-विशिष्ट या प्रेरणीय प्रमोटर से चलाकर, जीन केवल चुने स्थान या समय में विलोपित होता है, अतः जो प्राणी पूर्ण-शरीर नॉक-आउट से भ्रूण रूप में मर जाता, वह सामान्य विकसित होता है और जीन की वयस्क भूमिका जाँची जा सकती है।

  9. निम्नलिखित में से कौन-से उत्पाद व प्रकार सही युग्मित हैं? सभी लागू चुनें।

    1. पेनिसिलिन — द्वितीयक उपापचयज (वृद्धि-असंबद्ध)
    2. एथेनॉल — प्राथमिक उपापचयज (वृद्धि-संबद्ध)
    3. पॉलिहाइड्रॉक्सीब्यूटिरेट — एक सूक्ष्मजीवी भंडारण जैवप्लास्टिक
    4. सिट्रिक अम्ल — स्ट्रेप्टोमाइसीज़ से एक प्रतिजैविक
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — पेनिसिलिन — द्वितीयक उपापचयज (वृद्धि-असंबद्ध); B — एथेनॉल — प्राथमिक उपापचयज (वृद्धि-संबद्ध); C — पॉलिहाइड्रॉक्सीब्यूटिरेट — एक सूक्ष्मजीवी भंडारण जैवप्लास्टिक

    पेनिसिलिन द्वितीयक उपापचयज है, एथेनॉल वृद्धि-संबद्ध प्राथमिक उपापचयज, और PHB जैवप्लास्टिक के रूप में प्रयुक्त भंडारण पॉलिएस्टर। सिट्रिक अम्ल को स्ट्रेप्टोमाइसीज़ के प्रतिजैविक के रूप में जोड़ना दो बार ग़लत है: सिट्रिक अम्ल प्राथमिक उपापचयज (एक कार्बनिक अम्ल) है और कवक ऐस्पर्जिलस नाइजर द्वारा बनता है, स्ट्रेप्टोमाइसीज़ द्वारा नहीं, और वह प्रतिजैविक नहीं है।

  10. जब पुनर्योगज मानव इंसुलिन E. coli में अभिव्यक्त होता है, तो एक सामान्य डाउनस्ट्रीम चुनौती यह है कि प्रोटीन

    1. अविलेय अंतर्वेश पिंडों में संचित होता है जिन्हें विलेय कर पुनर्वलित करना पड़ता है
    2. अति-ग्लाइकोसिलीकृत होता है और उसे विग्लाइकोसिलीकृत करना पड़ता है
    3. दूध में स्रावित होता है और उसे केसीन से अलग करना पड़ता है
    4. परपोषी गुणसूत्र में समाकलित हो जाता है और पुनःप्राप्त नहीं हो सकता
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — अविलेय अंतर्वेश पिंडों में संचित होता है जिन्हें विलेय कर पुनर्वलित करना पड़ता है

    E. coli में किसी पराए प्रोटीन की उच्च-स्तरीय अभिव्यक्ति उसे प्रायः कुवलित समुच्चयों (अंतर्वेश पिंडों) के रूप में जमा करती है, जिन्हें पुनःप्राप्त कर, एक विकृतक से विलेय कर इन विट्रो पुनर्वलित किया जाता है। E. coli बिल्कुल ग्लाइकोसिलीकरण नहीं करता (अतः अति-ग्लाइकोसिलीकरण असंभव है) और दूध में स्रावित नहीं करता; अभिव्यक्ति प्लाज़्मिड एपिसोमी होते हैं, गुणसूत्रीय नहीं।

  11. चूहा एकल-क्लोनी प्रतिरक्षी नैदानिक उपयोग से पहले मुख्यतः किसलिए "मानवीकृत" किए जाते हैं?

    1. पराए (चूहा) प्रोटीन के विरुद्ध रोगी की प्रतिरक्षा अनुक्रिया घटाने हेतु
    2. उन्हें प्रतिजन से अधिक दृढ़ता से बाँधने हेतु
    3. उन्हें E. coli में उगाने योग्य बनाने हेतु
    4. उन्हें IgG से IgM में बदलने हेतु
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — पराए (चूहा) प्रोटीन के विरुद्ध रोगी की प्रतिरक्षा अनुक्रिया घटाने हेतु

    एक चूहा प्रतिरक्षी स्वयं एक पराया प्रोटीन है, अतः रोगी एक चूहा-विरोधी अनुक्रिया करता है जो उसे हटाती है और प्रतिक्रियाएँ कर सकती है; चूहा ढाँचा क्षेत्रों को मानव क्षेत्रों से बदलना (काइमेरिक, मानवीकृत या पूर्णतः मानव प्रतिरक्षी) इसे घटाता है। मानवीकरण प्रतिरक्षाजनकता के विषय में है, आसक्ति, परपोषी परास या प्रतिरक्षी वर्ग के नहीं।

  12. नए प्रतिजैविक उत्पादकों हेतु मृदा की जाँच में, किसी पृथक्कृत को प्राथमिक जाँच पर प्रायः किससे अभ्यर्थी माना जाता है?

    1. किसी परीक्षण जीव की परत पर अपने चारों ओर उत्पन्न वृद्धि संदमन क्षेत्र से
    2. लैक्टोस किण्वित करने की उसकी क्षमता से
    3. केवल उसके ग्राम-अभिरंजन रंग से
    4. जिस गति से वह बढ़ता है उससे
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — किसी परीक्षण जीव की परत पर अपने चारों ओर उत्पन्न वृद्धि संदमन क्षेत्र से

    प्रतिजैविक सक्रियता हेतु प्राथमिक जाँच एक स्वच्छ क्षेत्र खोजती है जहाँ पृथक्कृत ने अपने चारों ओर किसी परीक्षण जीव को संदमित किया हो (संकुलित-प्लेट या अगार-आवरण)। लैक्टोस किण्वन, ग्राम रंग व वृद्धि दर अपने आप यह नहीं बताते कि पृथक्कृत कोई संदमक यौगिक स्रावित करता है।

  13. अनेक प्राणी कोशिका माध्यमों में भ्रूणीय गोजातीय सीरम मुख्यतः किसकी आपूर्ति हेतु मिलाया जाता है?

    1. वृद्धि कारक, हार्मोन, आसंजन व वाहक प्रोटीन
    2. मुख्य कार्बन स्रोत
    3. CO₂/बाइकार्बोनेट बफ़र
    4. संदूषण के विरुद्ध प्रतिजैविक
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — वृद्धि कारक, हार्मोन, आसंजन व वाहक प्रोटीन

    सीरम वे वृद्धि कारक, हार्मोन, आसंजन कारक व वाहक/बंधन प्रोटीन देता है जो कोशिकाओं को चाहिए पर आधार माध्यम में नहीं होते; ग्लूकोस व ग्लूटामीन आधार माध्यम में कार्बन स्रोत हैं, बाइकार्बोनेट बफ़र है, और प्रतिजैविक अलग से मिलाए जाते हैं। सीरम-मुक्त माध्यम की ओर प्रवृत्ति ठीक इन्हीं अपरिभाषित सीरम घटकों को परिभाषित घटकों से बदलने हेतु है।

  14. पूर्वकेंद्रकीय सूक्ष्मअंतःक्षेपण द्वारा पारजीनी प्राणी बनाने की कौन-सी विशेषताएँ हैं? सभी लागू चुनें।

    1. DNA निषेचित अंडे के एक पूर्वकेंद्रक में अंतःक्षेपित किया जाता है
    2. पारजीन किसी यादृच्छिक स्थल पर, प्रायः कई प्रतियों में, समाकलित होता है
    3. समाकलन समजात पुनर्योजन द्वारा किसी चुने स्थल पर लक्षित होता है
    4. इसे दूध में चिकित्सीय प्रोटीन बनाने (जीन फ़ार्मिंग) हेतु प्रयुक्त किया जा सकता है
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — DNA निषेचित अंडे के एक पूर्वकेंद्रक में अंतःक्षेपित किया जाता है; B — पारजीन किसी यादृच्छिक स्थल पर, प्रायः कई प्रतियों में, समाकलित होता है; D — इसे दूध में चिकित्सीय प्रोटीन बनाने (जीन फ़ार्मिंग) हेतु प्रयुक्त किया जा सकता है

    पूर्वकेंद्रकीय सूक्ष्मअंतःक्षेपण DNA को एक पूर्वकेंद्रक में डालता है, जहाँ वह यादृच्छिक रूप से, प्रायः कई प्रतियों में, समाकलित होता है, और दूध में प्रोटीन स्रावित करने वाले प्राणी बनाने का मानक तरीका है। समजात पुनर्योजन द्वारा किसी परिभाषित स्थल पर लक्ष्यन जीन लक्ष्यन (नॉक-आउट/नॉक-इन) है, एक भिन्न विधि, अतः यह दावा कि समाकलन किसी चुने स्थल पर लक्षित होता है, सूक्ष्मअंतःक्षेपण का वर्णन नहीं करता।

  15. प्रेरित बहुशक्त मूल (iPS) कोशिकाएँ किससे उत्पन्न होती हैं?

    1. Oct4, Sox2, Klf4 व c-Myc जैसे कारकों से वयस्क कायिक कोशिकाओं का पुनर्क्रमादेशन
    2. B कोशिकाओं को मायलोमा कोशिकाओं से संलयित करके
    3. अंडे से केंद्रक हटाकर
    4. कोरकपुटी के अंतर्कोशिका पिंड का संवर्धन करके
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — Oct4, Sox2, Klf4 व c-Myc जैसे कारकों से वयस्क कायिक कोशिकाओं का पुनर्क्रमादेशन

    iPS कोशिकाएँ (ताकाहाशी व यामानाका) वयस्क कोशिकाएँ हैं जो पुनर्क्रमादेशन अनुलेखन कारकों के एक परिभाषित समुच्चय से बहुशक्तता तक लौटाई जाती हैं, भ्रूणों के उपयोग से बचते हुए। B-कोशिका/मायलोमा संलयन हाइब्रिडोमा बनाता है, अकेंद्रकन SCNT का एक चरण है, और अंतर्कोशिका पिंड का संवर्धन भ्रूणीय (प्रेरित नहीं) मूल कोशिकाएँ देता है।