पादप जैवप्रौद्योगिकी — पूर्णशक्तता, ऊतक व कोशिका संवर्धन, द्वितीयक उपापचयज व पारजीनी पादप
2. पादप वृद्धि नियामक व प्रेरक (एलिसिटर)
| वर्ग | उदाहरण | संवर्धन में मुख्य उपयोग |
|---|---|---|
| ऑक्सिन | IAA (प्राकृतिक), IBA, NAA, 2,4-D | कैलस प्रेरण (2,4-D सबसे प्रबल), मूलन (IBA, NAA), कायिक भ्रूणजनन का प्रेरण |
| साइटोकाइनिन | काइनेटिन, BAP, ज़ियाटिन, थायडायज़ुरॉन | कोशिका विभाजन, प्ररोह आरंभ व कक्षीय प्ररोह गुणन, शीर्ष प्रभाविता तोड़ना |
| जिबरेलिन | GA3 | प्ररोह दीर्घीकरण, भ्रूणों व बीजों का अंकुरण |
| ऐब्सिसिक अम्ल | ABA | कायिक भ्रूणों की परिपक्वता व शुष्कन सहिष्णुता (कृत्रिम बीजों हेतु), तनाव अनुक्रियाएँ |
| एथिलीन | एथिलीन गैस (बंद पात्रों में संचित) | प्रायः अवांछित — पत्ती विलगन व धीमी वृद्धि; पकना व जीर्णता |
प्रेरक (एलिसिटर) वे यौगिक हैं जो पादप कोशिका की रक्षा अनुक्रियाएँ, और उनके साथ अनेक द्वितीयक उपापचयजों (फ़ाइटोएलेक्सिन, ऐल्कलॉइड, टर्पीनॉइड, फ़ीनॉलिक) का संश्लेषण, आरंभ करते हैं। जैविक प्रेरक जीवों से आते हैं — कवक कोशिका-भित्ति के खंड, काइटोसैन, यीस्ट सार, ग्लूकन ओलिगोसैकेराइड — और अजैविक प्रेरक भौतिक या रासायनिक तनाव हैं — भारी धातु आयन, पराबैंगनी प्रकाश, परासरणी तनाव — साथ में संकेत अणु मिथाइल जैस्मोनेट व सैलिसिलिक अम्ल, जो स्वयं रक्षा पथों के भीतर कार्य करते हैं। प्रेरक ग्राहियों द्वारा पहचाना जाता है, आयन प्रवाह, क्रियाशील ऑक्सीजन व काइनेज़ शृंखलाएँ आरंभ करता है, और जैवसंश्लेषी जीनों का अनुलेखन चालू करता है। उसका प्रभाव मात्रा, समय व उद्भासन अवधि पर प्रबल रूप से निर्भर है: प्रेरण प्रायः घातांकी प्रावस्था के अंत में किया जाता है, जब पर्याप्त जैवभार हो, क्योंकि रक्षा अनुक्रिया संसाधनों को वृद्धि से हटाती है और उच्च मात्रा पर कोशिकाओं को मार सकती है।
वृद्धि नियामक प्रेरकों के साथ विनिमेय नहीं हैं: नियामक उन्हीं पथों पर विभाजन व आकारजनन चलाता है जिन्हें कोशिका वृद्धि हेतु पहले से प्रयोग करती है, जबकि प्रेरक कोशिका को रक्षात्मक द्वितीयक रसायन बनाने को प्रेरित करता है जिसे वह अन्यथा केवल आक्रमण पर बनाती। एक उत्पादन नियमावली प्रायः दोनों प्रयुक्त करती है — जैवभार बनाने हेतु नियामक, और उस जैवभार को उत्पाद की ओर मोड़ने हेतु अंत के निकट एक प्रेरक।
3. ऊतक व कोशिका निलंबन संवर्धन — विधि, वृद्धि बलगतिकी व पोषक अनुकूलन
विधि। एक कर्तोतक (पत्ती चक्रिका, तना खंड, भ्रूण, विभज्योतक) को सतह-निर्जर्मित किया जाता है — प्रायः 70% एथेनॉल में संक्षिप्त धुलाई, फिर सोडियम हाइपोक्लोराइट और निर्जर्म जल में बार-बार धुलाई — और एक माध्यम पर रखा जाता है, प्रायः मुराशिगे व स्कूग (MS) माध्यम (1962)। MS बृहत् पोषक (विशेषकर उच्च नाइट्रेट व अमोनियम नाइट्रोजन), सूक्ष्म पोषक, Fe-EDTA के रूप में लोहा, विटामिन (थायमिन, निकोटिनिक अम्ल, पिरिडॉक्सिन) व मायो-इनोसिटॉल, कार्बन स्रोत के रूप में सुक्रोस (लगभग 3%) क्योंकि संवर्धित ऊतक प्रकाश-संश्लेषण में आत्मनिर्भर नहीं होता, और वृद्धि नियामक देता है; कैलस हेतु इसे लगभग 0.8% अगार से ठोस किया जाता है और निलंबन हेतु द्रव रखा जाता है, pH 5.6–5.8 पर समायोजित कर ऑटोक्लेव किया जाता है। संवर्धन लगभग 25 °C पर, प्रायः 16-घंटे प्रकाशावधि में रखे जाते हैं। एक भुरभुरा कैलस — जो सरलता से टूट जाए — द्रव माध्यम में स्थानांतरित कर हिलाया जाता है (लगभग 100–120 rpm) ताकि कोशिका निलंबन बने, जिसे उसका एक भाग ताज़े माध्यम में तनु कर नियमित अंतराल पर उप-संवर्धित किया जाता है।
वृद्धि बलगतिकी। एक बैच निलंबन सिग्मॉइड वक्र का अनुसरण करता है — पश्चता, घातांकी, रैखिक, मंदन व स्थिर प्रावस्थाएँ — और वृद्धि ताज़े भार, शुष्क भार, संकुलित कोशिका आयतन, कोशिका संख्या (समूहों को अलग करने के बाद) या आयनों के अवशोषण से माध्यम चालकता में गिरावट द्वारा मापी जाती है। घातांकी प्रावस्था में जैवभार X = X0 e^(μt) का पालन करता है, अतः विशिष्ट वृद्धि दर μ = ln(X2/X1)/(t2 − t1) और द्विगुणन समय td = ln 2/μ है। पादप कोशिकाएँ धीमी हैं: उनके द्विगुणन समय एक दिन से कई दिनों की कोटि के हैं, जबकि जीवाणुओं के मिनटों से घंटों के — इसीलिए संदूषण पादप संवर्धन के विफल होने का सबसे सामान्य कारण है। वृद्धि सूचकांक (अंतिम जैवभार − प्रारंभिक जैवभार)/प्रारंभिक जैवभार है।
हल किया उदाहरण। एक निलंबन घातांकी वृद्धि के 6 दिनों में 2 से 8 g प्रति लीटर शुष्क भार तक बढ़ता है। तब μ = ln 4 / 6 = 1.386 / 6 = 0.231 प्रति दिन, td = 0.693 / 0.231 = 3.0 दिन (छह दिन में दो द्विगुणन, जैसा चार का गुणक बताता है), और वृद्धि सूचकांक (8 − 2)/2 = 3 है।
पोषक अनुकूलन। कार्बन स्रोत (सुक्रोस सांद्रता), नाइट्रोजन आपूर्ति व उसका अमोनियम : नाइट्रेट संतुलन, फ़ॉस्फ़ेट, और वृद्धि-नियामक स्तर सामान्य चर हैं, और सूक्ष्मजीवी माध्यमों की तरह इन्हें एक-एक करके नहीं बल्कि सांख्यिकीय रूप से परखा जाता है। परीक्षा प्रश्नों में दो तथ्य बार-बार आते हैं। पहला, वृद्धि व उत्पाद निर्माण को प्रायः भिन्न माध्यम चाहिए: फ़ॉस्फ़ेट या नाइट्रोजन सीमन व उच्च सुक्रोस वृद्धि रोककर द्वितीयक उपापचय चालू करते हैं, अतः द्वि-चरणीय संवर्धन वृद्धि माध्यम में जैवभार उगाकर फिर उसे उत्पादन माध्यम में स्थानांतरित करता है। दूसरा, पादप कोशिकाएँ बड़ी, रिक्तिकायुक्त व अपरूपण-संवेदी होती हैं, गुच्छों में जुड़ती हैं और साधारण ऑक्सीजन माँग रखती हैं, अतः उन्हें जीवाणुओं हेतु प्रयुक्त तीव्र विलोड़ित टैंकों के बजाय कम-अपरूपण पात्रों — एयरलिफ़्ट जैवरिएक्टर या कोमल इम्पेलर वाले विलोड़ित टैंक — में उगाया जाता है।
4. द्वितीयक उपापचयज, रोमिल मूल संवर्धन व औद्योगिक महत्त्व के पादप उत्पाद
द्वितीयक उपापचयज वे यौगिक हैं जो मूल वृद्धि हेतु आवश्यक नहीं पर रक्षा, संकेतन व रंग हेतु महत्त्वपूर्ण हैं, और वे ही पादप कोशिका संवर्धन के उद्योग होने का कारण हैं। तीन बड़े वर्ग हैं ऐल्कलॉइड (नाइट्रोजन-युक्त — कैथरैंथस रोज़ियस से विनब्लास्टीन व विनक्रिस्टीन, मॉर्फ़ीन, निकोटीन), टर्पीनॉइड (आइसोप्रीन इकाइयों से — टैक्सस से पैक्लिटैक्सेल, आर्टेमिसिया एनुआ से आर्टेमिसिनिन) और फ़ीनॉलिक (शिकिमेट व फ़ेनिलप्रोपेनॉइड मार्ग से — फ़्लेवोनॉइड, ऐंथोसायनिन, नैफ़्थोक्विनोन वर्णक शिकोनिन)। इनका संश्लेषण प्रायः वृद्धि-असंबद्ध होता है: वृद्धि धीमी होने पर बढ़ता है, प्रायः ऊतक-विशिष्ट होता है (कुछ यौगिक केवल मूलों या विशेष ग्रंथियों में बनते हैं), और अविभेदित कोशिकाओं में कम या अस्थिर हो सकता है।
- उच्च-उपज कोशिका वंशों का चयन — संवर्धन विषमांगी होते हैं, अतः क्लोनों को परखकर सर्वोत्तम उत्पादक रखे जाते हैं।
- माध्यम का अनुकूलन व दो चरण — एक वृद्धि माध्यम, फिर एक उत्पादन माध्यम (खंड 3)।
- प्रेरण — वृद्धि के अंत में मिथाइल जैस्मोनेट, काइटोसैन या कवक सार मिलाना।
- पूर्वगामी पोषण — जब पथ के किसी आरंभिक मध्यवर्ती की आपूर्ति प्रवाह को सीमित करे तो उसे देना (जैसे फ़ेनिलप्रोपेनॉइडों हेतु फ़ेनिलऐलानिन)।
- स्थिरीकरण व पारगम्यीकरण — फँसी कोशिकाएँ धीमे बढ़ती और अधिक समय उत्पादन करती हैं; पारगम्यकारी कारक रिक्तिका में संचित उत्पाद मुक्त करते हैं।
- उत्पाद का स्वस्थाने निष्कासन — दूसरी द्रव प्रावस्था या अधिशोषक रेज़िन उत्पाद ग्रहण करती है, जिससे पुनर्भरण संदमन व विषाक्तता घटते हैं।
रोमिल मूल संवर्धन एग्रोबैक्टीरियम राइज़ोजीन्स (अब राइज़ोबियम राइज़ोजीन्स वर्गीकृत) का उपयोग करता है। इसका Ri (मूल-प्रेरक) प्लाज़्मिड rol जीन (rolA, rolB, rolC) वहन करने वाला T-DNA घाव पर पादप जीनोम में स्थानांतरित करता है, और रूपांतरित कोशिकाएँ अत्यधिक शाखित मूलों के रूप में प्रचुरोद्भवन करती हैं। रोमिल मूल बिना मिलाए वृद्धि नियामकों के तेज़ी से बढ़ती हैं, अनेक उप-संवर्धनों में आनुवंशिक व जैवरासायनिक रूप से स्थिर रहती हैं (कैलस व निलंबन कोशिकाओं के विपरीत), और प्रजाति की सामान्य मूलों जैसे ही उपापचयज बनाती हैं — हायोसायमीन व स्कोपोलामीन जैसे ट्रोपेन ऐल्कलॉइड, जिनसेनोसाइड, और अन्य जिनके संश्लेषण को मूल विभेदन चाहिए। उनकी कमी अभियांत्रिकी है: उलझा मूल पिंड बड़े पैमाने पर उगाना कठिन है, अतः धुंध व बुलबुला-स्तंभ रिएक्टर प्रयुक्त होते हैं।
औद्योगिक महत्त्व के पादप उत्पादों में औषधियाँ (पैक्लिटैक्सेल, जो अब पादप कोशिका किण्वन से व्यावसायिक रूप से बनता है; विंका ऐल्कलॉइड; आर्टेमिसिनिन; कोडीन व मॉर्फ़ीन), रंजक व वर्णक (शिकोनिन — पादप कोशिका संवर्धन से व्यावसायिक रूप से बना पहला द्वितीयक उपापचयज, 1980 के दशक के आरंभ में जापान में — और ऐंथोसायनिन), सुगंध व मधुरक (वैनिलिन, स्टीवियोसाइड), प्राकृतिक कीटनाशी (पाइरेथ्रिन, नीम से ऐज़ाडिरैक्टिन), एंज़ाइम (पपीते के क्षीर से पपेन, ब्रोमेलेन), और औद्योगिक कच्चे माल (प्राकृतिक रबर, वनस्पति तेल, स्टार्च, रेशे) सम्मिलित हैं। पादप कोशिकाएँ पुनर्योगज प्रोटीनों की परपोषी भी हैं (आणविक कृषि): गौशे रोग हेतु प्रतिस्थापन एंज़ाइम टैलिग्लूसरेज़ ऐल्फ़ा, जो गाजर कोशिका निलंबनों में बनता है, 2012 में US FDA द्वारा पादप-कोशिका-निर्मित पहली जैवऔषधि के रूप में अनुमोदित हुआ।
5. कृत्रिम बीज, कायक्लोनी विभिन्नता, और जीवद्रव्यक संलयन — कायिक संकर व साइब्रिड
कृत्रिम (संश्लिष्ट) बीज सुरक्षात्मक जेल में आवेष्टित कायिक भ्रूण — या प्ररोह कलिकाएँ व अन्य प्रवर्ध — हैं ताकि उन्हें बीजों की तरह सँभाला और बोया जा सके। मानक विधि में प्रत्येक भ्रूण को सोडियम ऐल्जिनेट (कुछ प्रतिशत) में लेकर कैल्सियम क्लोराइड विलयन में टपकाया जाता है; कैल्सियम आयन ऐल्जिनेट को उसके चारों ओर एक अविलेय कैल्सियम ऐल्जिनेट मनके में तिर्यक-बंधित कर देते हैं, और पोषक, वृद्धि नियामक या कवकनाशी कृत्रिम भ्रूणपोष के रूप में मिलाए जा सकते हैं। जलयोजित संश्लिष्ट बीज शीघ्र बोने पड़ते हैं; शुष्कित बीज, जो ABA द्वारा शुष्कन-सहिष्णु बनाए परिपक्व भ्रूणों से बनते हैं, भंडारित किए जा सकते हैं। ये विशिष्ट संकरों तथा उन बंध्य या बीजरहित जीनोटाइपों हेतु प्रयुक्त होते हैं जिनका प्रवर्धन वास्तविक बीज से नहीं हो सकता, और जननद्रव्य विनिमय व संरक्षण हेतु।
कायक्लोनी विभिन्नता — वह शब्द जो लार्किन व स्कॉक्रॉफ़्ट ने 1981 में दिया — ऊतक संवर्धन से पुनर्जनित पौधों में दिखने वाली आनुवंशिक व एपिजेनेटिक विभिन्नता है। इसके कारण हैं गुणसूत्री परिवर्तन (असुगुणिता, बहुगुणिता, पुनर्व्यवस्थाएँ), बिंदु उत्परिवर्तन, परिवर्तनशील तत्वों का सक्रियण, जीन प्रवर्धन और DNA मेथिलीकरण में परिवर्तन। यह लंबी कैलस प्रावस्था, अनेक उप-संवर्धनों, 2,4-D जैसे प्रबल ऑक्सिनों, तथा प्रत्यक्ष के बजाय अप्रत्यक्ष पुनर्जनन से बढ़ती है; परागकोश या पराग संवर्धन से उत्पन्न विभिन्नता युग्मकक्लोनी कहलाती है। यह क्लोनी सूक्ष्मप्रवर्धन में बाधा है, जहाँ पौधों को मूल-प्ररूप के अनुरूप होना चाहिए, पर प्रजनकों हेतु उपयोगी विभेदों — रोग प्रतिरोध, तनाव सहिष्णुता — का स्रोत है, जो पुनर्जनितों को उनके लिए परखते हैं।
जीवद्रव्यक वे पादप कोशिकाएँ हैं जिनकी कोशिका भित्ति हटा दी गई हो, प्रायः एंज़ाइमी रूप से सेल्युलेज़ व पेक्टिनेज़ (मैसेरोज़ाइम) द्वारा एक परासरणी माध्यम (लगभग 0.4 से 0.6 M मैनिटॉल या सॉर्बिटॉल) में ताकि नग्न कोशिकाएँ फटें नहीं; जीवनक्षमता फ़्लुओरेसीन डाइऐसीटेट से जाँची जाती है, जिसे केवल जीवित कोशिकाएँ प्रतिदीप्त फ़्लुओरेसीन में बदलती हैं। जीवद्रव्यक DNA ग्रहण करते हैं, और उन्हें संलयित किया जा सकता है: पॉलिएथिलीन ग्लाइकॉल (उच्च pH व कैल्सियम सहित) द्वारा या वैद्युत-संलयन द्वारा (एक प्रत्यावर्ती क्षेत्र कोशिकाओं को पंक्तिबद्ध करता है, एक संक्षिप्त स्पंद उन्हें संलयित करता है)। संलयन लैंगिक असंगतता को दरकिनार करता है। जब दोनों साझेदारों के कोशिकाद्रव्यों के साथ उनके केंद्रक भी संलयित हों, तो पुनर्जनित पौधा दोनों केंद्रकीय जीनोम वहन करने वाला कायिक संकर होता है — उसकी गुणसूत्र संख्या जनकों का योग होती है (आलू–टमाटर “पोमैटो”, 48 + 24 = 72)। जब केवल कोशिकाद्रव्य मिलें और एक साझेदार का केंद्रक खो जाए — जानबूझकर, संलयन से पहले उसे विकिरित या अकेंद्रकित करके — तो उत्पाद साइब्रिड (कोशिकाद्रव्यी संकर) होता है: एक जनक का केंद्रक और दूसरे के अंगक। साइब्रिड कोशिकाद्रव्यी नर बंध्यता या हरितलवक-कूटित शाकनाशी प्रतिरोध जैसे कोशिकाद्रव्यतः वंशागत लक्षणों को किसी विशिष्ट केंद्रकीय पृष्ठभूमि में ले जाने का मार्ग हैं।
6. पारजीनी पादप — जीन स्थानांतरण, चयन चिह्नक व सूचक, लवक रूपांतरण
अप्रत्यक्ष जीन स्थानांतरण एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमीफ़ेसिएंस का उपयोग करता है, जो अपने Ti (अर्बुद-प्रेरक) प्लाज़्मिड का एक भाग पादप कोशिकाओं में स्थानांतरित कर मुकुट पिटिका रोग करता है। स्थानांतरित भाग, T-DNA, केवल अपनी 25-bp वाम व दक्षिण सीमा पुनरावृत्तियों से परिभाषित होता है; प्रकृति में यह ऑक्सिन व साइटोकाइनिन संश्लेषण (अतः अर्बुद) तथा जीवाणु का पोषण करने वाले ओपाइनों हेतु जीन वहन करता है। स्थानांतरण प्लाज़्मिड पर अन्यत्र स्थित vir जीनों द्वारा चलाया जाता है: VirA, एक झिल्ली संवेदक काइनेज़, घायल कोशिकाओं द्वारा मुक्त ऐसीटोसिरिंगोन जैसे फ़ीनॉलिक पहचानकर VirG को सक्रिय करता है, जो अन्य vir ओपेरॉन चालू करता है; VirD1 व VirD2 सीमाओं पर खाँचा बनाते हैं और VirD2 एकरज्जुकी T-रज्जुक के 5-प्राइम सिरे से सहसंयोजी रूप से जुड़ा रहता है, जिसे VirE2 आवृत करता है; VirB प्रोटीन प्रकार IV स्रावण वाहिका बनाते हैं जिससे वह गुज़रता है। अभियांत्रिकी हेतु T-DNA को निरस्त्र किया जाता है — अर्बुद जीन हटाकर वांछित जीन व एक चयन चिह्नक सीमाओं के बीच रखे जाते हैं। द्वि-आधारी वाहक तंत्र में छोटा T-DNA वाहक, जो E. coli व एग्रोबैक्टीरियम दोनों में प्रतिकृत होता है, एक सहायक Ti प्लाज़्मिड से अलग होता है जो vir जीन ट्रांस में देता है; पुराना सह-समाकलित तंत्र संरचना को एक निरस्त्र Ti प्लाज़्मिड में पुनर्योजित करता था। पत्ती चक्रिकाओं को जीवाणु के साथ सह-संवर्धित कर फिर चयनात्मक कारक व जीवाणु को मारने वाले प्रतिजैविक युक्त माध्यम पर ले जाया जाता है; ऐराबिडॉप्सिस को केवल फूल डुबोकर रूपांतरित किया जाता है (पुष्प निमज्जन)।
प्रत्यक्ष जीन स्थानांतरण बिना किसी जैविक वाहक के नग्न DNA पहुँचाता है। कण बमबारी (बायोलिस्टिक्स) DNA-लेपित स्वर्ण या टंगस्टन सूक्ष्मकणों को हीलियम-चालित बंदूक से अक्षत ऊतक में दागती है — वह विधि जिसने पहले अनाजों को रूपांतरित किया और लवकों में जाने का एकमात्र नियमित मार्ग। वैद्युतछिद्रण एक विद्युत स्पंद से अस्थायी छिद्र खोलता है, और PEG-माध्यित ग्रहण जीवद्रव्यकों पर कार्य करता है; सूक्ष्मअंतःक्षेपण, सिलिकॉन कार्बाइड तंतु व लिपोसोम कम प्रचलित हैं। प्रत्यक्ष विधियाँ जीनोटाइप-स्वतंत्र हैं और एग्रोबैक्टीरियम परपोषी परास नहीं माँगतीं, पर ये अनेक, पुनर्व्यवस्थित प्रतियाँ डालने की प्रवृत्ति रखती हैं, जो जीन शमन को बढ़ावा देता है; एग्रोबैक्टीरियम प्रायः कम, स्वच्छ प्रविष्टियाँ देता है। भारत का Bt कपास (कीटनाशी बैसिलस थुरिंजिएंसिस प्रोटीन हेतु एक cry जीन, 2002 में अनुमोदित) और गोल्डन राइस (दाने में प्रोविटामिन-A कैरोटीन हेतु फ़ाइटोईन सिंथेज़ व एक जीवाणुज कैरोटीन डीसैचुरेज़) वे पारजीनी पादप हैं जिन्हें परीक्षा सबसे अधिक नामित करेगी।
| जीन | उत्पाद व कारक | भूमिका |
|---|---|---|
| nptII | नियोमाइसिन फ़ॉस्फ़ोट्रांसफ़रेज़ — कैनामाइसिन प्रतिरोध | चयन चिह्नक: केवल रूपांतरज प्रतिजैविक में जीवित रहते हैं |
| hpt (hph) | हाइग्रोमाइसिन फ़ॉस्फ़ोट्रांसफ़रेज़ — हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोध | चयन चिह्नक, अनाजों हेतु व्यापक रूप से प्रयुक्त |
| bar / pat | फ़ॉस्फ़िनोथ्रिसिन ऐसीटिलट्रांसफ़रेज़ — ग्लूफ़ोसिनेट प्रतिरोध | शाकनाशी-प्रतिरोध चयन चिह्नक, फ़सल लक्षण भी |
| pmi (manA) | फ़ॉस्फ़ोमैनोस आइसोमरेज़ — कोशिकाओं को मैनोस पर बढ़ने देता है | धनात्मक चयन: शेष को मारने के बजाय रूपांतरज वृद्धि लाभ पाते हैं |
| uidA (gus) | बीटा-ग्लूकुरोनिडेज़ — X-Gluc एक अविलेय नीला अवक्षेप देता है | सूचक; ऊतक-रासायनिक अभिरंजन ऊतक को मार देता है (विनाशी) |
| gfp | हरित प्रतिदीप्त प्रोटीन — नीले या पराबैंगनी प्रकाश में प्रतिदीप्त, कोई अधःस्तर नहीं | जीवित ऊतक हेतु सूचक (अविनाशी), संलयन रूप में स्थान-निर्धारण |
चिह्नक जीनों का जारी फ़सल में रहना आवश्यक नहीं: उन्हें चिह्नक को एक अलग T-DNA पर रखकर सह-रूपांतरण द्वारा हटाया जा सकता है जो अगली पीढ़ी में पृथक हो जाता है, या पार्श्व loxP स्थलों पर क्रियाशील Cre रिकॉम्बिनेज़ द्वारा स्थल-विशिष्ट उच्छेदन से। लवक (हरितलवक) रूपांतरण जीनों को केंद्रक के बजाय लवक जीनोम में डालता है। DNA बायोलिस्टिक्स (या जीवद्रव्यकों में PEG) से पहुँचाया जाता है और पारजीन के पार्श्व लवक अनुक्रमों के बीच समजात पुनर्योजन से समाकलित होता है, अतः प्रविष्टि सटीक होती है और स्थिति प्रभाव अनुपस्थित रहते हैं। चयन *aadA* (ऐमिनोग्लाइकोसाइड ऐडेनिलिलट्रांसफ़रेज़, स्पेक्टिनोमाइसिन व स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोध) से होता है, और चूँकि एक पत्ती कोशिका में अनेक लवक होते हैं, प्रत्येक में जीनोम की अनेक प्रतियाँ, अतः समप्लाज़्मता — हर प्रति रूपांतरित — पाने हेतु चयनात्मक माध्यम पर पुनर्जनन के कई दौर चाहिए। लाभ हैं अत्यधिक उच्च अभिव्यक्ति (अनेक प्रतियों से), अनेक जीनों की एक ओपेरॉन के रूप में अभिव्यक्ति, कोई जीन शमन नहीं, और जीन परिरोधन, क्योंकि अधिकांश फ़सलों में लवक मातृवंशागत होते हैं और अतः पराग द्वारा नहीं फैलते। सीमाएँ हैं कि लवक प्रोटीनों का ग्लाइकोसिलीकरण नहीं करते, और नियमित लवक रूपांतरण केवल कुछ प्रजातियों में, सर्वोपरि तंबाकू में, स्थापित है।
मुख्य बिंदु
- पूर्णशक्तता निर्विभेदन, सक्षमता व पुनर्विभेदन से पुनः प्राप्त होती है; उच्च ऑक्सिन : साइटोकाइनिन मूल देता है, निम्न प्ररोह, मध्यवर्ती कैलस बनाए रखता है (स्कूग व मिलर)।
- प्रत्यक्ष अंगजनन व भ्रूणजनन कैलस को छोड़ देते हैं; अप्रत्यक्ष पुनर्जनन अधिक पादपक पर अधिक कायक्लोनी विभिन्नता देता है, जो कैलस आयु, उप-संवर्धनों व 2,4-D से बढ़ती है।
- निलंबन संवर्धन में mu = ln(X2/X1)/dt व td = ln 2/mu; द्वितीयक उपापचयज अधिकतर वृद्धि-असंबद्ध हैं, अतः द्वि-चरणीय संवर्धन, प्रेरण, पूर्वगामी पोषण व स्वस्थाने निष्कासन उपज बढ़ाते हैं।
- रोमिल मूल Ri प्लाज़्मिड के rol जीनों से आती हैं, बिना हार्मोन बढ़ती और स्थिर रहती हैं; कायिक संकर दोनों केंद्रकीय जीनोम जोड़ता है, साइब्रिड एक केंद्रक के साथ पराए अंगक रखता है।
- एग्रोबैक्टीरियम vir जीनों द्वारा 25-bp सीमाओं के बीच का T-DNA स्थानांतरित करता है (द्वि-आधारी वाहक उन्हें ट्रांस में देते हैं); बायोलिस्टिक्स प्रत्यक्ष है; लवक रूपांतरण aadA प्रयुक्त करता है, समप्लाज़्मता माँगता है और मातृ परिरोधन सहित उच्च अभिव्यक्ति देता है।
अभ्यास प्रश्न (17)
उत्तर खोलने से पहले प्रत्येक प्रश्न हल करें। हर व्याख्या सही विकल्प के साथ लुभावना गलत विकल्प भी बताती है, क्योंकि अंक वहीं जाते हैं।
तंबाकू कैलस संवर्धन में माध्यम को उच्च ऑक्सिन : साइटोकाइनिन अनुपात वाले माध्यम से बदला जाता है। सबसे संभावित बनने वाली संरचनाएँ हैं
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उत्तर: A — मूल
स्कूग व मिलर ने दिखाया कि ऑक्सिन : साइटोकाइनिन अनुपात अंग भाग्य तय करता है: उच्च अनुपात मूलों के पक्ष में, निम्न अनुपात प्ररोहों के, मध्यवर्ती अनुपात असंगठित कैलस के। प्ररोहों हेतु साइटोकाइनिन बढ़ाना पड़ता, और कायिक भ्रूण में परिभाषा से दोनों ध्रुव होते हैं, अतः मूल-ध्रुव-रहित भ्रूण विरोधाभास है।प्रजाति A के जीवद्रव्यकों को उनके केंद्रक निष्क्रिय करने हेतु विकिरित कर फिर प्रजाति B के सामान्य जीवद्रव्यकों से संलयित किया जाता है। पुनर्जनित पौधे का सर्वोत्तम वर्णन है
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उत्तर: A — B के केंद्रक व A तथा B के अंगकों वाला साइब्रिड
विकिरण A के केंद्रक को नष्ट करता है पर उसका कोशिकाद्रव्य छोड़ देता है, अतः संलयन उत्पाद केवल B का केंद्रकीय जीनोम, A से आ सकने वाले अंगकों के साथ, रखता है: साइब्रिड, कोशिकाद्रव्यी नर बंध्यता स्थानांतरित करने का क्लासिक तरीका। कायिक संकर दोनों केंद्रक और गुणसूत्र संख्याओं का योग वहन करता।रोमिल मूल संवर्धनों के विषय में कौन-सा कथन सही है?
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उत्तर: A — वे एग्रोबैक्टीरियम राइज़ोजीन्स के Ri प्लाज़्मिड से प्रेरित होती हैं और बिना मिलाए वृद्धि नियामकों के बढ़ती हैं
Ri प्लाज़्मिड T-DNA पर स्थित rol जीन रूपांतरित कोशिकाओं को ऐसी मूलों के रूप में प्रचुरोद्भवित करते हैं जिन्हें बाह्य ऑक्सिन या साइटोकाइनिन नहीं चाहिए। रोमिल मूल अनेक उप-संवर्धनों में उल्लेखनीय रूप से स्थिर हैं, कैलस से अधिक, और इन्हें ठीक इसलिए प्रयुक्त किया जाता है कि वे ट्रोपेन ऐल्कलॉइड जैसे मूल-विशिष्ट उपापचयज बनाती हैं।घातांकी वृद्धि में एक पादप कोशिका निलंबन 8 दिनों में 3 g प्रति लीटर से 12 g प्रति लीटर शुष्क भार तक बढ़ता है। इसका द्विगुणन समय ______ दिन है।
संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।
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उत्तर: 4
चौगुनी वृद्धि दो द्विगुणन है (2^2 = 4), अतः दो द्विगुणन में 8 दिन लगे और td = 4 दिन। औपचारिक रूप से mu = ln 4 / 8 = 0.1733 प्रति दिन और td = 0.693 / 0.1733 = 4.0 दिन। 8 दिनों को 4 से, या 12 − 3 = 9 से, भाग देना घातांकी व रैखिक वृद्धि को मिला देता है।तंबाकू के हरितलवक रूपांतरण में पारजीन सामान्यतः किस द्वारा समाकलित व चयनित किया जाता है?
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उत्तर: A — पार्श्व लवक अनुक्रमों के बीच समजात पुनर्योजन, चिह्नक के रूप में aadA (स्पेक्टिनोमाइसिन प्रतिरोध)
लवक वाहक पारजीन को लवक DNA के दो खंडों के बीच रखते हैं, अतः वह समजात पुनर्योजन से सटीक रूप से समाकलित होता है; स्पेक्टिनोमाइसिन व स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोध देने वाला aadA मानक लवक चिह्नक है, और बार-बार पुनर्जनन पौधों को समप्लाज़्मता तक ले जाता है। T-DNA समाकलन केंद्रकीय प्रक्रिया है।संश्लिष्ट (कृत्रिम) बीज सामान्यतः किस प्रकार बनाए जाते हैं?
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उत्तर: A — सोडियम ऐल्जिनेट को कैल्सियम क्लोराइड में टपकाकर बने कैल्सियम ऐल्जिनेट मनकों में कायिक भ्रूणों को आवेष्टित करके
कैल्सियम आयन प्रत्येक कायिक भ्रूण के चारों ओर ऐल्जिनेट को अविलेय जेल मनके में तिर्यक-बंधित करते हैं, और मनका कृत्रिम भ्रूणपोष के रूप में पोषक वहन कर सकता है। द्रव नाइट्रोजन में जमाना परिशीतन-संरक्षण है और PEG संलयन संकर बनाता है; कोई भी बोने योग्य प्रवर्ध नहीं देता।कण बमबारी की तुलना में एग्रोबैक्टीरियम-माध्यित रूपांतरण की कौन-सी विशेषताएँ हैं? सभी लागू चुनें।
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उत्तर: A — यह पारजीन की कम, स्वच्छ प्रतियाँ डालने की प्रवृत्ति रखता है; B — स्थानांतरित DNA 25-bp सीमा पुनरावृत्तियों से परिभाषित होता है; C — इसे ऐसीटोसिरिंगोन जैसे फ़ीनॉलिकों द्वारा vir जीनों के प्रेरण की आवश्यकता होती है
एग्रोबैक्टीरियम 25-bp सीमाओं से घिरी कम, अधिक सुपरिभाषित प्रविष्टियाँ देता है और घाव-फ़ीनॉलिकों द्वारा vir प्रेरण पर निर्भर है। लवक वह अपवाद हैं जहाँ यह नहीं पहुँच सकता: चूँकि एग्रोबैक्टीरियम T-DNA केंद्रक में पहुँचाता है, लवक रूपांतरण बायोलिस्टिक्स से होता है, अतः यह दावा कि एग्रोबैक्टीरियम लवकों का एकमात्र नियमित मार्ग है, वास्तव में बमबारी का वर्णन करता है, एग्रोबैक्टीरियम का नहीं।प्रत्यक्ष कायिक भ्रूणजनन अप्रत्यक्ष कायिक भ्रूणजनन से मुख्यतः इस बात में भिन्न है कि प्रत्यक्ष भ्रूणजनन
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उत्तर: A — बीच में कैलस के बिना सीधे कर्तोतक कोशिकाओं से भ्रूण बनाता है
प्रत्यक्ष भ्रूणजनन कैलस चरण छोड़ देता है, अतः भ्रूण सीधे कर्तोतक कोशिकाओं से बनते हैं; अप्रत्यक्ष भ्रूणजनन पहले कैलस से गुज़रता है, जहाँ कायक्लोनी विभिन्नता संचित होती है। दोनों द्विध्रुवी भ्रूण देते हैं, और किसी को एग्रोबैक्टीरियम या विशेष माध्यम-अवस्था नहीं चाहिए।एक कोशिका निलंबन 0.10 प्रति घंटा विशिष्ट वृद्धि दर से बढ़ता है। 0.5 g प्रति लीटर से आरंभ कर, घातांकी वृद्धि के 24 घंटों के बाद जैवभार ______ g प्रति लीटर है (एक दशमलव स्थान तक)।
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उत्तर: 5.5
X = X0 e^(mu t) = 0.5 * e^(0.10 * 24) = 0.5 * e^2.4 = 0.5 * 11.023 = 5.51 g प्रति लीटर। रैखिक दर (0.5 + 0.10 * 24 = 2.9) प्रयोग करना इस तथ्य की उपेक्षा करता है कि वृद्धि चक्रवृद्धि होती है; गुणक e^2.4 है, 1 + 2.4 नहीं।पादप कोशिका निलंबन से किसी वृद्धि-असंबद्ध द्वितीयक उपापचयज की उपज प्रायः सबसे अधिक किससे सुधरती है?
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उत्तर: A — द्वि-चरणीय संवर्धन: वृद्धि माध्यम पर जैवभार, फिर प्रेरक सहित उत्पादन माध्यम में स्थानांतरण
वृद्धि-असंबद्ध उत्पाद वृद्धि धीमी होने पर संचित होता है, अतः वृद्धि व उत्पादन को भिन्न दशाएँ चाहिए: जैवभार एक समृद्ध वृद्धि माध्यम पर बनाया जाता है और फिर प्रेरक सहित उत्पादन माध्यम (प्रायः पोषक-सीमित, उच्च-सुक्रोस) में स्थानांतरित किया जाता है। अधिकतम पोषक व स्थायी घातांकी वृद्धि उत्पाद दबाते हैं, और उच्च अपरूपण इन नाज़ुक कोशिकाओं को क्षति पहुँचाता है।सूचक जीन चयन चिह्नक से इस बात में भिन्न है कि सूचक जीन
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उत्तर: A — एक उत्पाद बनाता है जिसे देखा या मापा जा सके पर स्वयं कोशिका को चयनात्मक कारक में जीवित नहीं रखता
gus, gfp या luc जैसा सूचक दिखाता है कि प्रमोटर कहाँ व कितनी प्रबलता से सक्रिय है पर कोई उत्तरजीविता लाभ नहीं देता; nptII या hpt जैसा चयन चिह्नक रूपांतरित कोशिकाओं को उस कारक में जीवित रखता है जो शेष को मारता है। Cre या loxP उच्छेदन चिह्नकों को रूपांतरण के बाद हटाता है, पहले नहीं।एक चतुर्गुणित आलू (2n = 4x = 48) को एक द्विगुणित टमाटर (2n = 2x = 24) से संलयित किया जाता है, और केंद्रक संलयित होकर एक सममित कायिक संकर देते हैं। संकर कोशिका की गुणसूत्र संख्या ______ है।
संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।
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उत्तर: 72
एक सममित कायिक संकर दोनों पूर्ण केंद्रकीय जीनोम वहन करता है, अतः गुणसूत्र संख्याएँ जुड़ती हैं: 48 + 24 = 72। साइब्रिड केवल एक जनक का केंद्रक (48 या 24) रखता; युग्मक संख्या तक आधा करना लैंगिक संकरण पर लागू होता, कायिक कोशिकाओं के जीवद्रव्यक संलयन पर नहीं।कौन-सा हार्मोन कायिक भ्रूणों को परिपक्व करने और भंडारणीय कृत्रिम बीजों हेतु आवश्यक शुष्कन सहिष्णुता देने से सर्वाधिक संबद्ध है?
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उत्तर: A — ऐब्सिसिक अम्ल
ABA कायिक भ्रूणों को परिपक्व करता है और वह शुष्कन सहिष्णुता प्रेरित करता है जो उन्हें सुखाकर भंडारणीय संश्लिष्ट बीज बनने देती है। 2,4-D कैलस प्रेरण हेतु प्रबल ऑक्सिन है, जिबरेलिन अंकुरण (प्रसुप्ति का विपरीत) बढ़ाता है और काइनेटिन प्ररोहों हेतु साइटोकाइनिन है।कायक्लोनी विभिन्नता तब सबसे कम समस्या होने की संभावना है जब लक्ष्य है
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उत्तर: A — नए रोग-प्रतिरोधी विभेदों हेतु पुनर्जनित पौधों की जाँच
कायक्लोनी विभिन्नता वहाँ अवांछित है जहाँ पौधों को जनक के समरूप होना चाहिए — सूक्ष्मप्रवर्धन, एकरूप रोपण स्टॉक, प्रमाणित मातृ स्टॉक — पर तब उपयोगी है जब उद्देश्य रोग प्रतिरोध जैसे नए विभेद उत्पन्न व चयनित करना हो। वहाँ वह सामग्री का स्रोत है, दोष नहीं।पादप पूर्णशक्तता व संवर्धन में उसके उपयोग के विषय में निम्नलिखित में से कौन-से सत्य हैं? सभी लागू चुनें।
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उत्तर: A — एक विभेदित कायिक कोशिका पूरे जननक्षम पौधे का पुनर्जनन कर सकती है; B — विभाजित होती, प्रायः कैलस-निर्माणी अवस्था तक निर्विभेदन पुनर्विभेदन से पहले आता है; C — पादप कोशिकाएँ अधिकांश विभेदित जंतु कोशिकाओं से अधिक सहजता से पूर्णशक्तता दिखाती हैं
एक अकेली पादप कोशिका को पूरे पौधे तक लौटाया जा सकता है, निर्विभेदन और फिर पुनर्विभेदन से गुज़रते हुए, और पादप कोशिकाएँ यह अधिकांश जंतु कोशिकाओं से कहीं अधिक सहजता से करती हैं। यह दावा कि पूर्णशक्तता हेतु अधिकांश जीनोम खोना पड़ता है, असत्य है: पूर्णशक्तता जीनोम के बने रहने व पुनः सक्रिय होने योग्य होने पर निर्भर है, खो जाने पर नहीं।एक कोशिका निलंबन 1.0 g प्रति लीटर पर आरोपित किया जाता है और घातांकी रूप से बढ़ते हुए 5 दिनों के बाद 6.0 g प्रति लीटर तक पहुँचता है। इसकी विशिष्ट वृद्धि दर ______ प्रति दिन है (दो दशमलव स्थान तक)।
संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।
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उत्तर: 0.36
mu = ln(X2/X1)/(t2 − t1) = ln(6.0/1.0)/5 = ln 6 / 5 = 1.7918/5 = 0.358, जो 0.36 प्रति दिन तक पूर्णांकित होता है। रैखिक ढाल (6 − 1)/5 = 1.0 प्रयोग करना इस तथ्य की उपेक्षा करता है कि घातांकी वृद्धि अनुपात के लघुगणक से शासित होती है, अंतर से नहीं।एग्रोबैक्टीरियम-माध्यित रूपांतरण की द्वि-आधारी वाहक प्रणाली में वांछित जीन व vir जीन क्रमशः कहाँ स्थित होते हैं?
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उत्तर: A — एक छोटे T-DNA वाहक (E. coli व एग्रोबैक्टीरियम में प्रतिकृत) पर और एक अलग सहायक Ti प्लाज़्मिड पर
द्वि-आधारी प्रणाली कार्यों को बाँटती है: वांछित जीन एक छोटे शटल वाहक पर सीमाओं के बीच बैठता है, जबकि vir जीन उसी कोशिका में एक अलग सहायक Ti प्लाज़्मिड से ट्रांस में दिए जाते हैं। दोनों को एक निरस्त्र Ti प्लाज़्मिड पर रखना पुराना सह-समाकलित उपाय है, जिसे द्वि-आधारी प्रणाली ने प्रतिस्थापित किया क्योंकि बड़े Ti प्लाज़्मिड में क्लोनन असुविधाजनक है।