सूक्ष्मजीव विज्ञान की विधियाँ: शुद्ध संवर्धन, निर्जर्मीकरण, पोषण, निदान, सूक्ष्मदर्शिकी, PCR व CRISPR-Cas

यह अध्याय जीवन विज्ञान (XL) पेपर के पाँच वैकल्पिक खंडों में से एक, XL3 सूक्ष्मजीव विज्ञान, के खंड XL3.2 का उत्तर है: “Pure culture techniques; Disinfection and Sterilization: principles, methods and assessment of efficacy; Principles of microbial nutrition; Enrichment culture techniques for isolation of microorganisms; Antigen and antibody detection methods for microbial diagnosis; Light-, phase contrast-, fluorescence- and electron-microscopy; PCR, Real-time PCR for quantitation of microbes; CRISPR-Cas.” यह सिखाता है कि एक प्रकार के सूक्ष्मजीव को कैसे पृथक किया, पोषित किया और गिना जाता है, सूक्ष्मजीवों को कैसे मारा जाता है और उस मारक प्रभाव को कैसे मापा जाता है, उन्हें कैसे देखा जाता है, और उनके प्रतिजनों, उनके विरुद्ध बने प्रतिरक्षियों व उनके DNA से उनका पता कैसे लगाया जाता है। आंकिक प्रश्न क्रमिक तनुकरण से पट्टिका गणना, लॉग ह्रास तथा D- व z-मान, ऐबे विभेदन सीमा, और रियल-टाइम PCR के देहली चक्रों से प्रतिलिपि-संख्या हैं।

1. शुद्ध संवर्धन तकनीकें

शुद्ध (axenic) संवर्धन एक ही कोशिका का वंशज होता है। यह अपूतिक तकनीक (ज्वाला में तपाया लूप, निर्जर्म माध्यम, ज्वाला के पास या जैवसुरक्षा कैबिनेट में कार्य) से और कोशिकाओं को ठोस माध्यम पर इतना विरल फैलाकर मिलता है कि हर एक अलग कॉलोनी बनाए। लाल-शैवालीय पॉलीसैकेराइड अगार पसंदीदा ठोसकारक है: कुछ ही सूक्ष्मजीव इसे पचाते हैं, यह लगभग 85 °C या उससे ऊपर ही पिघलता है, फिर भी ठंडा होने पर लगभग 45 °C तक द्रव रहता है और 40 °C के निकट जमता है। रेखन पट्टिका कोशिकाओं को पट्टिका के खंडों में यांत्रिक रूप से तनु करती है और केवल पृथक्करण हेतु है। प्रसार पट्टिका किसी तनुता का 0.1 mL सतह पर फैलाती है। ढलाई पट्टिका 1 mL को 45–50 °C तक ठंडे किए पिघले अगार में मिलाती है, अतः कॉलोनियाँ अगार के भीतर व सतह दोनों पर उगती हैं; क्षणिक तापन ताप-संवेदी कोशिकाओं को हानि पहुँचा सकता है। शुद्ध संवर्धन उपसंवर्धन, −80 °C पर ग्लिसरॉल में हिमीकरण या हिम-शुष्कन से रखे जाते हैं।

🧠 हल किया उदाहरण: क्रमिक तनुकरण से जीवक्षम गणना
प्रति mL CFU = कॉलोनियाँ ÷ (पट्टित आयतन mL में × तनुता)। एक संवर्धन को क्रमशः दस-गुना तनु किया जाता है; 10⁻⁵ तनुता का 0.1 mL 214 कॉलोनियाँ देता है और 10⁻⁶ तनुता का 0.1 mL 23। केवल परंपरागत 30–300 परास वाली पट्टिका गिनें (कुछ मानक 25–250 लेते हैं): 214 ÷ (0.1 × 10⁻⁵) = 2.14 × 10⁸ CFU mL⁻¹। पट्टित 0.1 mL भूलने पर उत्तर दस गुना कम आता है।
⚠️ एक कॉलोनी सदा एक कोशिका नहीं होती
शृंखलाएँ व गुच्छे एक-एक कॉलोनी देते हैं, और मृत या जीवक्षम-पर-असंवर्धनीय कोशिकाएँ कोई नहीं देतीं, इसलिए पट्टिका गणना कॉलोनी-निर्माण इकाइयाँ बताती है और प्रायः सूक्ष्मदर्शी गणना से कम होती है, जिसमें मृत कोशिकाएँ भी गिनी जाती हैं।

2. सूक्ष्मजीवी पोषण व संवर्धन-समृद्धि

हर कोशिका को ऊर्जा, इलेक्ट्रॉनों (अपचायक शक्ति) और कार्बन का स्रोत चाहिए। प्रकाश-उपयोगी प्रकाश- (photo-), रासायनिक-उपयोगी रस- (chemo-) कहलाते हैं; अकार्बनिक इलेक्ट्रॉन दाता जीव को अकार्बनिकपोषी (litho-), कार्बनिक दाता कार्बनिकपोषी (organo-) बनाते हैं; कार्बन हेतु CO₂ उसे स्वपोषी, कार्बनिक कार्बन परपोषी बनाता है। बृहत् पोषक C, H, O, N, S, P, K, Mg, Ca व Fe हैं; Mn, Zn, Co, Cu, Mo (नाइट्रोजिनेज़ में) व Ni (यूरिएज़ व हाइड्रोजिनेज़ों में) जैसे सूक्ष्म तत्व अत्यल्प मात्रा में चाहिए। वृद्धि कारक (अमीनो अम्ल, प्यूरीन व पिरिमिडीन, विटामिन) पोषणअपूर्णों (auxotrophs) को चाहिए, पोषणपूर्णों (prototrophs) को नहीं। माध्यम परिभाषित (हर घटक ज्ञात) या जटिल (पेप्टोन, यीस्ट निष्कर्ष) होते हैं; वरणात्मक माध्यम अवांछित जीवों को दबाते हैं, विभेदक माध्यम समूहों को भिन्न दिखाते हैं, और समृद्ध माध्यम (रक्त, चॉकलेट अगार) दुष्पोष्य जीवों को पालते हैं। मैकॉन्की अगार वरणात्मक (पित्त लवण व क्रिस्टल वायलेट ग्राम-धनात्मकों को रोकते हैं) और विभेदक (लैक्टोज़-किण्वक न्यूट्रल रेड से गुलाबी होते हैं) दोनों है; मैनिटॉल लवण अगार 7.5% NaCl से स्टैफ़िलोकोकाई का चयन करता है।

पोषण प्रकार
प्रकारऊर्जा; इलेक्ट्रॉन; कार्बनउदाहरण
प्रकाश-अकार्बनिक-स्वपोषीप्रकाश; H₂O या H₂S; CO₂सायनोजीवाणु, बैंगनी सल्फ़र जीवाणु
प्रकाश-कार्बनिक-परपोषीप्रकाश; कार्बनिक अम्ल; कार्बनिक कार्बनबैंगनी असल्फ़र जीवाणु
रस-अकार्बनिक-स्वपोषीNH₃, NO₂⁻, H₂S, Fe²⁺ या H₂ का ऑक्सीकरण; CO₂Nitrosomonas, Acidithiobacillus
रस-कार्बनिक-परपोषीतीनों हेतु कार्बनिक यौगिकEscherichia coli, कवक, प्रोटोज़ोआ

संवर्धन-समृद्धि (बेयरिंक व विनोग्रैडस्की) ऐसा माध्यम व परिस्थितियाँ बनाती है जिनमें वांछित शरीरक्रिया जीते, बार-बार स्थानांतरण करती है, फिर शुद्धीकरण हेतु रेखन करती है। संयुक्त नाइट्रोजन का अभाव, कार्बनिक कार्बन-स्रोत व वायु Azotobacter जैसे वायुजीवी N₂-स्थिरकों को समृद्ध करते हैं; एकमात्र ऊर्जा-स्रोत के रूप में अमोनियम और कार्बन हेतु बाइकार्बोनेट, अँधेरे में, अमोनिया-ऑक्सीकारकों को; प्रकाश, H₂S व ऑक्सीजन का अभाव प्रकाशपोषी सल्फ़र जीवाणुओं को; और एकमात्र कार्बन-स्रोत के रूप में कोई प्रदूषक उसके अपघटकों को समृद्ध करता है। विनोग्रैडस्की स्तंभ (सेलुलोज़, सल्फ़ेट व कार्बोनेट युक्त कीचड़, बगल से प्रकाशित) ऊपर से O₂ और नीचे से H₂S की विपरीत प्रवणताएँ बनाता है, और समुदाय उनके अनुदिश स्तरित होते हैं: ऊपर शैवाल व सायनोजीवाणु, बीच में बैंगनी व हरे जीवाणु, नीचे सल्फ़ेट-अपचायक।

3. निर्जर्मीकरण व विसंक्रमण: सिद्धांत, विधियाँ व प्रभावकारिता

निर्जर्मीकरण अंतःबीजाणुओं सहित हर जीवक्षम जीव को नष्ट करता या हटाता है; यह निरपेक्ष है। विसंक्रमण निर्जीव वस्तुओं पर रोगजनकों को घटाता है, पूतिरोधन (antisepsis) यही जीवित ऊतक पर करता है, और स्वच्छीकरण गणना को सुरक्षित माने गए स्तर तक लाता है; इनमें से किसी को बीजाणु मारना आवश्यक नहीं। कारक -नाशी (-cidal) (मारते हैं) या -रोधी (-static) (वृद्धि उत्क्रमणीय रूप से रोकते हैं) होते हैं। प्रतिरोध मोटे तौर पर इस क्रम में घटता है: प्रायॉन, जीवाणु अंतःबीजाणु, माइकोबैक्टीरिया, छोटे आवरणहीन विषाणु, कायिक जीवाणु व कवक, और सबसे सरल, आवरणयुक्त विषाणु।

सामान्य विधियाँ
विधिविशिष्ट परिस्थितियाँ व क्रियाउपयोग
ऑटोक्लेव (आर्द्र ताप)121 °C, वायुमंडल से लगभग 15 psi अधिक, छोटे भार हेतु 15–20 min; प्रोटीन स्कंदित करता है; बीजाणु मारता हैमाध्यम, काँच के पात्र, अपशिष्ट
गर्म-वायु ओवन (शुष्क ताप)160–170 °C पर लगभग 2 h; ऑक्सीकरण; आर्द्र ताप से अधिक तापमान व समय चाहिएशुष्क काँच के पात्र, चूर्ण, तेल
पाश्चरीकरण63 °C पर 30 min या 72 °C पर 15 s; रोगजनक मारता है, बीजाणु नहींदूध, रस
झिल्ली निस्यंदन0.22 µm छिद्र जीवाणु रोकते हैं; HEPA फ़िल्टर वायु स्वच्छ करते हैंताप-अस्थिर विलयन: प्रतिजैविक, विटामिन, सीरम
आयनकारी विकिरणगामा किरणें या इलेक्ट्रॉन पुंज; मुक्त मूलकों से DNA विखंडन; पैकेजिंग भेदता हैडिस्पोज़ेबल प्लास्टिक, सिरिंज
UV प्रकाश (लगभग 260 nm)पिरिमिडीन (थाइमीन) द्वितय; अति क्षीण भेदनसतहें, वायु, कैबिनेट
रसायनएथिलीन ऑक्साइड गैस व ग्लूटैरैल्डिहाइड ऐल्किलीकरण करते हैं और बीजाणुनाशी हैं; 70% एथेनॉल, हाइपोक्लोराइट, आयोडीन, फ़ीनॉलिक व चतुष्क अमोनियम यौगिक विसंक्रमण करते हैंताप-संवेदी उपकरण; सतहें, त्वचा

प्रभावकारिता का आकलन। घातक कारक के अधीन मृत्यु प्रथम कोटि की है: हर समान अंतराल में समान अंश मरता है, अतः log N समय के साथ रैखिक रूप से घटता है। D-मान किसी बताए तापमान पर वह समय (या मात्रा) है जो 90% को, यानी एक लॉग चक्र को, मारता है; लॉग ह्रास = log₁₀(N₀/N); N₀ से N तक पहुँचने का समय D × log₁₀(N₀/N) है। z-मान वह तापमान-वृद्धि है जो D को दस गुना घटाए। उदाहरण: 121 °C पर 12 min में उत्तरजीवी 10⁶ से 10² रह जाते हैं, 4-लॉग ह्रास, अतः D₁₂₁ = 3 min; 10⁶ से 10⁻⁶ के निर्जर्मता आश्वासन स्तर (दस लाख में एक उत्तरजीवी वस्तु) तक पहुँचने में 12 लॉग, यानी 36 min लगेंगे। यदि D 121 °C पर 3 min और 111 °C पर 30 min है, तो z = 10 °C। व्यवहार में जैविक सूचक (भाप हेतु Geobacillus stearothermophilus के, शुष्क ताप व एथिलीन ऑक्साइड हेतु Bacillus atrophaeus के बीजाणु) सिद्ध करते हैं कि चक्र प्रभावी है; रासायनिक सूचक टेप केवल दिखाता है कि तापमान पहुँचा। विसंक्रामकों की तुलना फ़ीनॉल गुणांक (परीक्षण कारक की वह तनुता जो मानक जीव को निर्धारित समय में मारे, भाग फ़ीनॉल की तुल्य तनुता) और दूषित वाहकों पर उपयोग-तनुता परीक्षणों से होती है।

⚠️ 70% एथेनॉल शुद्ध एथेनॉल से बेहतर क्यों है
ऐल्कोहॉल द्वारा प्रोटीन के विकृतीकरण व कोशिका-भेदन हेतु जल आवश्यक है; शुद्ध एथेनॉल सतह को निर्जलित करता है और शीघ्र वाष्पित हो जाता है। कोई भी अंतःबीजाणु नहीं मारता, अतः ऐल्कोहॉल विसंक्रामक या पूतिरोधी है, निर्जर्मक कभी नहीं।

4. प्रकाश, प्रावस्था-विपर्यास, प्रतिदीप्ति व इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शिकी

कुल आवर्धन अभिदृश्यक × नेत्रिका है, पर सूक्ष्मदर्शी को सीमित करने वाली विभेदन क्षमता है, वह न्यूनतम दूरी जिस पर दो बिंदु दो दिखें। इसे विवर्तन तय करता है: d = 0.61 λ/NA (रैले रूप; ऐबे का अपना रूप d = λ/2NA भी प्रयुक्त होता है, अतः प्रश्न को बताना चाहिए कि कौन-सा)। संख्यात्मक द्वारक NA = n sin θ है, जहाँ n नमूने व लेंस के बीच का अपवर्तनांक है और θ अभिदृश्यक द्वारा ग्रहण किए प्रकाश-शंकु का अर्धकोण। वायु (n = 1) NA को 1 से नीचे रखती है; निमज्जन तेल (n ≈ 1.5) उसे लगभग 1.25–1.4 तक उठाता है। λ = 550 nm और NA = 1.25 पर d = 0.61 × 550/1.25 ≈ 270 nm, अतः लगभग 0.2 µm प्रकाश सूक्ष्मदर्शिकी की व्यावहारिक सीमा है। लगभग 1000 × NA से अधिक आवर्धन रिक्त आवर्धन है: बड़ा, पर अधिक स्पष्ट नहीं।

सूक्ष्मदर्शियों की तुलना
सूक्ष्मदर्शीविपर्यास या प्रतिबिंब कैसे बनता हैसर्वोत्तम उपयोग
दीप्त-क्षेत्रदीप्त पृष्ठभूमि पर अभिरंजित कोशिकाओं द्वारा अवशोषणग्राम, अम्ल-स्थायी, अंतःबीजाणु अभिरंजन; संपुटिकाओं हेतु ऋणात्मक अभिरंजन (इंडिया इंक)
अदीप्त-क्षेत्रप्रकाश का खोखला शंकु; केवल वस्तु द्वारा प्रकीर्णित प्रकाश अभिदृश्यक में जाता हैTreponema जैसे पतले जीवित सर्पिलाणु
प्रावस्था-विपर्यास (ज़र्निके)वलयाकार संघनित्र डायाफ़्राम व प्रावस्था-पट्टिका अपवर्तनांक-अंतरों से उत्पन्न प्रावस्था-विस्थापन को दीप्ति-अंतर में बदलते हैंजीवित, अनभिरंजित कोशिकाएँ, अंतःबीजाणु, अंतर्विष्ट, गतिशीलता
प्रतिदीप्ति (एपिफ़्लोरेसेंस, कॉन्फ़ोकल)प्रतिदीप्तिवर्णक लघु-तरंगदैर्ध्य प्रकाश अवशोषित कर दीर्घ-तरंगदैर्ध्य प्रकाश उत्सर्जित करता है (स्टोक्स विस्थापन); फ़िल्टर व द्विवर्णी दर्पण केवल उत्सर्जन पार होने देते हैं; कॉन्फ़ोकल पिनहोल अफ़ोकसित प्रकाश रोकता हैDNA हेतु DAPI, माइकोबैक्टीरिया हेतु ऑरामीन, अंकित प्रतिरक्षी, rRNA प्रोब (FISH), GFP संलयन
पारगमन इलेक्ट्रॉन (TEM)निर्वात में, विद्युतचुंबकीय लेंसों से फ़ोकसित इलेक्ट्रॉन भारी धातुओं से अभिरंजित अति-पतले काटों से गुज़रते हैं; विभेदन 1 nm से काफ़ी नीचेआंतरिक संरचना, ऋणात्मक अभिरंजन से विषाणु, बृहदणुओं की क्रायो-EM
क्रमवीक्षण इलेक्ट्रॉन (SEM)फ़ोकसित पुंज धातु-लेपित सतह का क्रमवीक्षण करता है; द्वितीयक इलेक्ट्रॉन प्रतिबिंब बनाते हैंत्रिविमीय सतह-दृश्य; कुछ nm का विभेदन, TEM से स्थूल
⚠️ प्रत्येक विधि क्या नहीं करती
प्रावस्था-विपर्यास विपर्यास जोड़ता है, विभेदन नहीं। प्रतिदीप्ति उत्सर्जन सदा उत्तेजन से दीर्घ तरंगदैर्ध्य पर होता है। इलेक्ट्रॉन कहीं अधिक विभेदित करते हैं क्योंकि उनका तरंगदैर्ध्य कहीं छोटा है, पर निर्वात के कारण TEM व SEM मृत, स्थिरीकृत नमूने देखते हैं (क्रायो-EM उन्हें हिमीकृत-जलयोजित अवस्था में रखती है)। ऋणात्मक अभिरंजन में पृष्ठभूमि गहरी होती है और वस्तु हल्की रहती है।

5. निदान हेतु प्रतिजन व प्रतिरक्षी संसूचन

सूक्ष्मजीवी प्रतिजन मिलना दिखाता है कि सूक्ष्मजीव या उसका उत्पाद अभी उपस्थित है; प्रतिरक्षी मिलना दिखाता है कि परपोषी ने अनुक्रिया की है। IgM हाल के या वर्तमान संक्रमण का चिह्न है; IgG स्वस्थ होने या टीकाकरण के बाद भी बना रहता है, अतः एकल IgG अनुमापांक संक्रमण का समय नहीं बता सकता, पर तीव्र व स्वास्थ्यलाभ सीरमों के बीच चार गुना या अधिक वृद्धि बता सकती है। अनुमापांक सीरम की उस उच्चतम तनुता का व्युत्क्रम है जो अब भी धनात्मक अभिक्रिया दे।

  • समूहन: प्रतिरक्षी कणों को दृश्य गुच्छों में पार-बंधित करता है। वाइडल परीक्षण Salmonella Typhi के O व H प्रतिजनों के प्रति प्रतिरक्षी मापता है; प्रतिरक्षी-लेपित लेटेक्स मनके प्रमस्तिष्क-मेरु द्रव में संपुटिका प्रतिजन पकड़ते हैं। प्रोज़ोन में अतिरिक्त प्रतिरक्षी हर कण को अलग-अलग ढक लेता है, जालक नहीं बनता और अतनु सीरम मिथ्या ऋणात्मक पढ़ा जा सकता है।
  • जेल में विलेय प्रतिजन का अवक्षेपण (ऑक्टरलोनी द्वि-विसरण, अरीय प्रतिरक्षा-विसरण) तुल्यता क्षेत्र में अधिकतम होता है।
  • ELISA: प्रतिरक्षी पर लगा एंज़ाइम (हॉर्सरैडिश पेरॉक्सिडेज़ या क्षारीय फ़ॉस्फ़ेटेज़) किसी क्रियाधार को रंगीन बनाता है। अप्रत्यक्ष ELISA प्रतिजन लेपित करता है और रोगी का प्रतिरक्षी एंज़ाइम-अंकित प्रति-मानव इम्युनोग्लोबुलिन से पकड़ता है (प्रतिरक्षी जाँच)। सैंडविच ELISA प्रतिजन को भिन्न एपिटोपों के दो प्रतिरक्षियों के बीच पकड़ता है (प्रतिजन संसूचन)। प्रतिस्पर्धी ELISA में विश्लेष्य बढ़ने पर संकेत घटता है।
  • पार्श्व-प्रवाह त्वरित परीक्षण यही रसायन एक पट्टी पर स्वर्ण-अंकित प्रतिरक्षी, परीक्षण रेखा व नियंत्रण रेखा के साथ चलाते हैं; प्रतिरक्षा-प्रतिदीप्ति प्रतिदीप्तिवर्णक-अंकित प्रतिरक्षी को सीधे नमूने पर या अंकित द्वितीय प्रतिरक्षी के माध्यम से अप्रत्यक्ष रूप से प्रयोग करती है; वेस्टर्न ब्लॉट प्रोब करने से पहले प्रोटीनों को आकार से पृथक करता है, जिससे वह पुष्टिकारक परीक्षण बनता है।

6. PCR व मात्रात्मक रियल-टाइम PCR

PCR दो प्राइमरों के बीच के DNA खंड की प्रतिलिपियाँ बार-बार के चक्रों से बनाता है: विकृतीकरण (लगभग 94–95 °C), प्राइमरों का तापानुशीतन (annealing) (प्रायः 50–65 °C, उनके गलनतापमान से कुछ डिग्री नीचे) और तापस्थायी DNA पॉलिमरेज़ द्वारा 72 °C पर विस्तार: Thermus aquaticus का Taq, जिसमें 3′→5′ प्रूफ़रीडिंग नहीं है, या Pyrococcus furiosus का Pfu जैसा प्रूफ़रीडिंग एंज़ाइम। अभिक्रिया को dNTP व Mg²⁺ भी चाहिए। आदर्श स्थिति में लक्ष्य हर चक्र में दुगुना होता है, N = N₀ × 2ⁿ; दक्षता E पर N = N₀(1 + E)ⁿ। तीस आदर्श चक्र एक प्रतिलिपि को 2³⁰ ≈ 1.07 × 10⁹ गुना करते हैं, फिर अभिकर्मक चुकते हैं और अभिक्रिया पठार पर पहुँचती है। RNA विषाणु व्युत्क्रम अनुलेखन के बाद (RT-PCR) पकड़े जाते हैं। PCR असंवर्धनीय व धीमे बढ़ने वाले रोगजनकों, जैसे Mycobacterium tuberculosis, को घंटों में पकड़ता है, पर मृत कोशिकाओं का DNA भी पकड़ लेता है।

रियल-टाइम (मात्रात्मक) PCR हर चक्र में प्रतिदीप्ति पढ़ता है। SYBR Green किसी भी द्विरज्जुकी DNA से बंधकर प्रतिदीप्त होता है, अतः एकल उत्पाद दिखाने हेतु गलन-वक्र चाहिए; TaqMan जल-अपघटन प्रोब पर रिपोर्टर व क्वेंचर होते हैं और वह तभी प्रतिदीप्त होता है जब पॉलिमरेज़ का 5′→3′ एक्सोन्यूक्लिएज़ अपने लक्ष्य से बंधे प्रोब को काटे, जिससे वह अनुक्रम-विशिष्ट बनता है। देहली चक्र (Ct, या Cq) वह चक्र है जिस पर प्रतिदीप्ति निर्धारित देहली पार करती है; टेम्पलेट जितना अधिक, उतना पहले, अतः कम Ct का अर्थ अधिक लक्ष्य। 100% दक्षता पर एक चक्र दो गुने अंतर के बराबर है और दस गुना अंतर log₂10 = 3.32 चक्र है। Ct बनाम log₁₀(प्रतिलिपियाँ) का मानक वक्र 100% दक्षता पर −3.32 ढलान रखता है, और दक्षता E = 10^(−1/ढलान) − 1।

🧠 हल किया उदाहरण: मानक वक्र से प्रतिलिपियाँ
मानक वक्र Ct = 40.0 − 3.32 log₁₀N₀ पढ़ता है। एक नमूना Ct = 26.72 देता है। तब log₁₀N₀ = (40.0 − 26.72)/3.32 = 13.28/3.32 = 4.00, अतः अभिक्रिया में N₀ = 10⁴ प्रतिलिपियाँ। प्रति mL नमूना प्रतिलिपियाँ पाने हेतु निष्कर्ष के उस अंश से गुणा करें जो नली में डाला गया।

7. CRISPR-Cas: एक प्रोकैरियोटी प्रतिरक्षा तंत्र व एक उपकरण

CRISPR स्थल (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) समान पुनरावृत्तियों की एक शृंखला है जिनके बीच अद्वितीय स्पेसर होते हैं, प्रत्येक किसी पूर्व आक्रामक फ़ेज या प्लाज़्मिड का खंड, और इसके पास cas जीन होते हैं; अनेक जीवाणुओं व अधिकांश आर्किया में यह होता है। प्रतिरक्षा तीन चरणों में चलती है। अनुकूलन: Cas1–Cas2 संकुल आक्रामक DNA से एक छोटा प्रोटोस्पेसर पकड़ता है, जो किसी PAM (protospacer-adjacent motif) के पास से चुना जाता है, और उसे शृंखला के लीडर-सिरे पर नए स्पेसर के रूप में जोड़ता है, अतः शृंखला पिछले संक्रमणों का वंशानुगत अभिलेख है। अभिव्यक्ति: शृंखला अनुलेखित होकर छोटे crRNA में संसाधित होती है; टाइप II तंत्रों में एक tracrRNA पुनरावृत्ति से युग्मित होता है और RNase III काटता है। व्यतिकरण: crRNA किसी Cas न्यूक्लिएज़ को मेल खाते आक्रामक न्यूक्लिक अम्ल तक ले जाता है और वह उसे काटता है। कोशिका की अपनी शृंखला के स्पेसरों के पास PAM नहीं होता, इसी से तंत्र स्वयं पर आक्रमण से बचता है।

वर्ग 1 तंत्र (टाइप I, III, IV) बहु-प्रोटीन प्रभावक संकुल प्रयोग करते हैं; वर्ग 2 तंत्र एक बड़ा प्रोटीन। Cas9 (टाइप II) अपने HNH व RuvC डोमेनों से द्विरज्जुकी DNA काटता है और PAM से 3 bp ऊर्ध्वप्रवाह एक कुंद विच्छेद छोड़ता है (Streptococcus pyogenes के एंज़ाइम हेतु PAM 5′-NGG-3′)। Cas12a (टाइप V) को tracrRNA नहीं चाहिए, वह T-समृद्ध PAM पहचानता है और असम (staggered) काट बनाता है; Cas13 (टाइप VI) RNA काटता है। संपादन हेतु crRNA व tracrRNA को 20-न्यूक्लियोटाइड मार्गदर्शक वाले एक एकल-मार्गदर्शी RNA में संलयित किया जाता है; विच्छेद की मरम्मत त्रुटिप्रवण असमजात सिरा-संयोजन (जीन निष्क्रियण) से या दिए गए टेम्पलेट से समजात-निर्देशित मरम्मत (सटीक संपादन) से होती है, और न्यूक्लिएज़-निष्क्रिय dCas9 बिना काटे जीनों का दमन करता है। लक्ष्य से बंधने पर Cas12a व Cas13 पास के रिपोर्टर अणुओं को भी अविवेकी रूप से काटते हैं (संपार्श्विक विदलन), जो DETECTR (Cas12a) व SHERLOCK (Cas13) जैसे CRISPR निदान का आधार है।

मुख्य बिंदु

  • शुद्ध संवर्धन रेखन, प्रसार या ढलाई पट्टिकाओं की एकल कॉलोनियों से आते हैं; प्रति mL CFU = कॉलोनियाँ ÷ (पट्टित आयतन × तनुता), बताए परास (परंपरागत रूप से 30–300) वाली पट्टिकाओं पर गिना जाता है।
  • पोषण प्रकार = ऊर्जा (प्रकाश/रस) + इलेक्ट्रॉन (अकार्बनिक/कार्बनिक) + कार्बन (स्व/पर)। माध्यम परिभाषित या जटिल, वरणात्मक, विभेदक या समृद्ध होते हैं; संवर्धन-समृद्धि रेखन से पहले वांछित शरीरक्रिया को बाकी से आगे बढ़ने देती है।
  • सूक्ष्मजीवी मृत्यु प्रथम कोटि की है: समय = D × log₁₀(N₀/N), z वह तापमान-वृद्धि है जो D को दस गुना घटाए। ऑटोक्लेव 121 °C, 15 psi, 15–20 min; शुष्क ताप 160–170 °C, 2 h; ताप-अस्थिर द्रवों हेतु 0.22 µm फ़िल्टर; G. stearothermophilus के बीजाणु भाप-चक्र को प्रमाणित करते हैं।
  • विभेदन d = 0.61 λ/NA (रूप बताएँ); निमज्जन तेल NA बढ़ाता है और प्रकाश सूक्ष्मदर्शिकी लगभग 0.2 µm पर रुक जाती है। प्रावस्था-विपर्यास जीवित कोशिकाओं में विपर्यास जोड़ता है, प्रतिदीप्ति दीर्घ तरंगदैर्ध्य पर उत्सर्जित होती है, TEM 1 nm से नीचे विभेदित करता है और SEM सतहें दिखाता है।
  • प्रतिजन संसूचन वर्तमान उपस्थिति दिखाता है; IgM या अनुमापांक में चार गुना वृद्धि हाल का संक्रमण दिखाती है। अप्रत्यक्ष ELISA प्रतिरक्षी, सैंडविच ELISA प्रतिजन पकड़ता है; प्रोज़ोन अतनु सीरम में मिथ्या ऋणात्मक देता है।
  • qPCR में कम Ct का अर्थ अधिक टेम्पलेट है; 100% दक्षता पर दस गुना अंतर 3.32 चक्र है और E = 10^(−1/ढलान) − 1। CRISPR-Cas प्रतिरक्षा PAM-आश्रित लक्ष्यीकरण के साथ अनुकूलन, अभिव्यक्ति व व्यतिकरण चलाती है; Cas9 कुंद DNA विच्छेद बनाता है, Cas12a व Cas13 संपार्श्विक-विदलन निदान चलाते हैं।

अभ्यास प्रश्न (18)

उत्तर खोलने से पहले प्रत्येक प्रश्न हल करें। हर व्याख्या सही विकल्प के साथ लुभावना गलत विकल्प भी बताती है, क्योंकि अंक वहीं जाते हैं।

  1. एक जीवाणु संवर्धन को क्रमशः दस-गुना तनु किया जाता है। 10⁻⁶ तनुता का 0.1 mL फैलाने पर 156 कॉलोनियाँ मिलती हैं (10⁻⁵ पट्टिका गिनने हेतु बहुत भीड़ भरी है)। मूल संवर्धन की जीवक्षम गणना, 10⁸ CFU प्रति mL की इकाइयों में, ____ है (एक दशमलव स्थान तक)।

    संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।

    उत्तर देखें

    उत्तर: 15.6

    प्रति mL CFU = कॉलोनियाँ ÷ (पट्टित आयतन × तनुता) = 156 ÷ (0.1 × 10⁻⁶) = 1.56 × 10⁹ CFU प्रति mL = 15.6 × 10⁸। पट्टित 0.1 mL की उपेक्षा करने पर 1.56 आता है, जो दस गुना त्रुटि है।

  2. प्रकाश में अवायवीय रूप से बढ़ते बैंगनी असल्फ़र जीवाणु, जो मैलेट को कार्बन-स्रोत व इलेक्ट्रॉन दाता दोनों के रूप में प्रयोग करते हैं, सबसे उपयुक्त रूप में हैं

    1. प्रकाश-अकार्बनिक-स्वपोषी
    2. प्रकाश-कार्बनिक-परपोषी
    3. रस-कार्बनिक-परपोषी
    4. रस-अकार्बनिक-स्वपोषी
    उत्तर देखें

    उत्तर: B — प्रकाश-कार्बनिक-परपोषी

    प्रकाश से ऊर्जा उन्हें प्रकाश- बनाती है, कार्बनिक इलेक्ट्रॉन दाता (मैलेट) कार्बनिक- और कार्बनिक कार्बन परपोषी। प्रकाश-अकार्बनिक-स्वपोषी लुभावना विकल्प है क्योंकि ये जीवाणु H₂ या अल्प सल्फ़ाइड व CO₂ पर भी बढ़ सकते हैं, पर बताई परिस्थितियों में नहीं। रस- प्रकार प्रकाश का उपयोग नहीं करते।

  3. एक छात्र बगीचे की मिट्टी से अमोनिया-ऑक्सीकारी जीवाणुओं को समृद्ध करना चाहता है। कौन-सा माध्यम व ऊष्मायन उन्हें कहीं अधिक संख्या वाले परपोषियों की तुलना में सबसे वरणात्मक रूप से लाभ देगा?

    1. एकमात्र ऊर्जा-स्रोत अमोनियम व एकमात्र कार्बन बाइकार्बोनेट वाले खनिज लवण, वायवीय, अँधेरे में
    2. ग्लूकोज़ व अमोनियम युक्त खनिज लवण, वायवीय, अँधेरे में, ताकि अमोनियम प्रचुर मात्रा में उपलब्ध रहे
    3. मैनिटॉल युक्त व संयुक्त नाइट्रोजन-रहित खनिज लवण, वायवीय, ताकि अमोनियम केवल कोशिकाएँ ही बनाएँ
    4. लैक्टेट, सल्फ़ेट व अमोनियम युक्त खनिज लवण, अवायवीय, ताकि ऑक्सीजन अमोनियम का ऑक्सीकरण न कर सके
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — एकमात्र ऊर्जा-स्रोत अमोनियम व एकमात्र कार्बन बाइकार्बोनेट वाले खनिज लवण, वायवीय, अँधेरे में

    अमोनिया-ऑक्सीकारक वायुजीवी रस-अकार्बनिक-स्वपोषी हैं: उन्हें इलेक्ट्रॉन दाता के रूप में NH₄⁺, ग्राही के रूप में O₂ और कार्बन हेतु CO₂ चाहिए। कार्बनिक कार्बन हटाने से परपोषी भूखे रहते हैं, और अँधेरा प्रकाशपोषियों को बाहर रखता है। ग्लूकोज़ डालने पर परपोषी छा जाते हैं; N-रहित मैनिटॉल माध्यम Azotobacter जैसे N₂-स्थिरकों को समृद्ध करता है; अवायवीय लैक्टेट–सल्फ़ेट माध्यम सल्फ़ेट-अपचायकों को समृद्ध करता है, और O₂ के बिना नाइट्रीकारक श्वसन नहीं कर सकते।

  4. संवर्धन माध्यमों के बारे में निम्नलिखित में से कौन-से कथन सही हैं?

    1. मैकॉन्की अगार वरणात्मक व विभेदक दोनों है
    2. पेप्टोन व यीस्ट निष्कर्ष युक्त माध्यम रासायनिक रूप से परिभाषित है
    3. मैनिटॉल लवण अगार स्टैफ़िलोकोकाई के चयन हेतु 7.5% NaCl प्रयोग करता है
    4. पोषणअपूर्ण जीव उस वृद्धि कारक से रहित न्यूनतम माध्यम पर उगता है जिसकी उसे आवश्यकता है
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — मैकॉन्की अगार वरणात्मक व विभेदक दोनों है; C — मैनिटॉल लवण अगार स्टैफ़िलोकोकाई के चयन हेतु 7.5% NaCl प्रयोग करता है

    मैकॉन्की के पित्त लवण व क्रिस्टल वायलेट ग्राम-धनात्मकों के विरुद्ध चयन करते हैं, और लैक्टोज़ व न्यूट्रल रेड किण्वकों को (गुलाबी) विभेदित करते हैं। मैनिटॉल लवण अगार का उच्च लवण स्टैफ़िलोकोकाई का चयन करता है। पेप्टोन व यीस्ट निष्कर्ष की सटीक संरचना अज्ञात है, अतः ऐसा माध्यम जटिल है, परिभाषित नहीं; और पोषणअपूर्ण जीव परिभाषा से ही अपने आवश्यक वृद्धि कारक के बिना नहीं उग सकता।

  5. 10 min लगाया गया एक विसंक्रामक दूषित वाहक पर जीवक्षम गणना 5.0 × 10⁶ CFU से 50 CFU कर देता है। प्राप्त लॉग ह्रास ____ है।

    संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।

    उत्तर देखें

    उत्तर: 5

    लॉग ह्रास = log₁₀(N₀/N) = log₁₀(5.0 × 10⁶ / 50) = log₁₀(10⁵) = 5, यानी 99.999% मृत्यु। गणनाओं को घटाना या केवल आरंभिक गणना का लघुगणक लेना सामान्य भूलें हैं।

  6. 121 °C पर एक उत्तरजीविता-वक्र प्रयोग में बीजाणु गणना 10 min में 2.0 × 10⁶ से 2.0 × 10² हो जाती है। प्रथम कोटि मृत्यु मानते हुए, प्रति वस्तु 10⁵ बीजाणुओं के भार को प्रति वस्तु 10⁻⁶ उत्तरजीविता-प्रायिकता तक लाने हेतु 121 °C पर आवश्यक समय मिनटों में ____ है (एक दशमलव स्थान तक)।

    संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।

    उत्तर देखें

    उत्तर: 27.5

    प्रयोग 10 min में 4-लॉग गिरावट दिखाता है, अतः D₁₂₁ = 10/4 = 2.5 min। 10⁵ से 10⁻⁶ तक जाना log₁₀(10⁵/10⁻⁶) = 11 लॉग चक्र है, अतः t = 11 × 2.5 = 27.5 min। केवल 5 लॉग (एक उत्तरजीवी तक) गिनने पर 12.5 min आता है, जो सामान्य भूल है।

  7. भाप ऑटोक्लेव चक्र ने निर्जर्मीकरण प्राप्त किया है, इसकी पुष्टि हेतु नियमित रूप से कौन-सा जैविक सूचक प्रयुक्त होता है?

    1. कागज़ की पट्टी पर सुखाई Staphylococcus aureus की कायिक कोशिकाएँ
    2. कागज़ की पट्टी पर सुखाए Bacillus atrophaeus के बीजाणु
    3. बंद शीशी में Geobacillus stearothermophilus के बीजाणु
    4. पोषक शोरबे में Pseudomonas aeruginosa का निलंबन
    उत्तर देखें

    उत्तर: C — बंद शीशी में Geobacillus stearothermophilus के बीजाणु

    Geobacillus stearothermophilus के बीजाणु आर्द्र ताप के प्रति अति प्रतिरोधी हैं, अतः उनकी मृत्यु सिद्ध करती है कि भाप-चक्र सफल रहा। Bacillus atrophaeus के बीजाणु लुभावना विकल्प हैं: वे शुष्क ताप व एथिलीन ऑक्साइड के सूचक हैं। कायिक जीवाणु इतनी आसानी से मरते हैं कि निर्जर्मता सिद्ध नहीं कर सकते।

  8. एक बीजाणु निलंबन हेतु 121 °C पर D 1.5 min और 111 °C पर D 15 min है। log D व तापमान के बीच सरल-रेखीय संबंध मानते हुए, कौन-सा युग्म z-मान व 131 °C पर अपेक्षित D देता है?

    1. z = 10 °C; 131 °C पर D = 0.75 min
    2. z = 13.5 °C; 131 °C पर D = 0.15 min
    3. z = 1 °C; 131 °C पर D = 0.015 min
    4. z = 10 °C; 131 °C पर D = 0.15 min
    उत्तर देखें

    उत्तर: D — z = 10 °C; 131 °C पर D = 0.15 min

    10 °C वृद्धि पर D दस गुना घटता है (15 से 1.5 min), अतः z = 10 °C। अगली 10 °C वृद्धि D को फिर दस गुना घटाती है: 1.5/10 = 0.15 min। दूसरे चरण में D आधा करना (0.75 min) z को दोगुने-नियम जैसा मानना है; 13.5 D-मानों को घटाने से आता है, जिसका कोई अर्थ नहीं।

  9. निर्जर्मीकरण व विसंक्रमण के बारे में निम्नलिखित में से कौन-से कथन सही हैं?

    1. 0.22 µm झिल्ली से निस्यंदन ताप-अस्थिर प्रतिजैविक विलयन हेतु उपयुक्त है
    2. 70% एथेनॉल शुद्ध एथेनॉल से बेहतर विसंक्रामक है क्योंकि जल प्रोटीन विकृतीकरण में सहायक है
    3. 254 nm का UV प्रकाश बंद अपारदर्शी प्लास्टिक पात्रों की सामग्री को निर्जर्म करता है
    4. 121 °C पर 15 min शुष्क ताप 121 °C पर 15 min ऑटोक्लेविंग जितना प्रभावी है
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — 0.22 µm झिल्ली से निस्यंदन ताप-अस्थिर प्रतिजैविक विलयन हेतु उपयुक्त है; B — 70% एथेनॉल शुद्ध एथेनॉल से बेहतर विसंक्रामक है क्योंकि जल प्रोटीन विकृतीकरण में सहायक है

    झिल्ली निस्यंदन बिना ताप के जीवाणु हटाता है, और जल के कारण 70% एथेनॉल शुद्ध एथेनॉल से बेहतर भेदन व विकृतीकरण करता है। UV का भेदन अति क्षीण है और वह अपारदर्शी पात्रों के भीतर नहीं पहुँच सकता। शुष्क ताप संतृप्त भाप से कहीं कम प्रभावी ढंग से ऊष्मा पहुँचाता है, अतः उसे लगभग 160–170 °C पर लगभग 2 h चाहिए।

  10. d = 0.61 λ/NA प्रयोग करते हुए, 520 nm तरंगदैर्ध्य के हरे प्रकाश में देखने वाले 1.30 संख्यात्मक द्वारक के तेल-निमज्जन अभिदृश्यक की विभेदन सीमा nm में ____ है।

    संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।

    उत्तर देखें

    उत्तर: 244

    d = 0.61 × 520 nm ÷ 1.30 = 317.2 ÷ 1.30 = 244 nm, लगभग 0.24 µm। इसके स्थान पर ऐबे का रूप λ/2NA लेने पर 200 nm आता, इसीलिए प्रश्न सूत्र बताता है। अधिक NA या छोटा तरंगदैर्ध्य d घटाता है, यानी विभेदन सुधारता है।

  11. प्रावस्था-विपर्यास सूक्ष्मदर्शी एक छात्र को जीवित, अनभिरंजित जीवाणुओं के अंतःबीजाणु व अंतर्विष्ट देखने देता है। यह किस कारण संभव होता है?

    1. अपवर्तनांक-अंतरों से हुए छोटे प्रावस्था-विस्थापन दीप्ति के अंतरों में बदल दिए जाते हैं
    2. लघु-तरंगदैर्ध्य प्रकाश स्रोत विभेदन क्षमता को दीप्त-क्षेत्र प्रकाशिकी से कहीं अधिक बढ़ा देता है
    3. केवल कोशिका-किनारों से प्रकीर्णित प्रकाश अभिदृश्यक में जाता है, अतः कोशिकाएँ काले क्षेत्र पर चमकती हैं
    4. कोशिका घटक पराबैंगनी उत्तेजक प्रकाश अवशोषित कर दीर्घ तरंगदैर्ध्य का दृश्य प्रकाश उत्सर्जित करते हैं
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — अपवर्तनांक-अंतरों से हुए छोटे प्रावस्था-विस्थापन दीप्ति के अंतरों में बदल दिए जाते हैं

    ज़र्निके का वलयाकार डायाफ़्राम व प्रावस्था-पट्टिका सघन संरचनाओं से गुज़रे प्रकाश के सूक्ष्म प्रावस्था-विलंब को दीप्ति के दृश्य अंतर में बदल देते हैं, अतः अभिरंजक नहीं चाहिए। प्रावस्था-विपर्यास विभेदन नहीं सुधारता। काले क्षेत्र पर प्रकीर्णित प्रकाश अदीप्त-क्षेत्र सूक्ष्मदर्शिकी का वर्णन है, जो लुभावना विकल्प है, और अवशोषण के बाद दीर्घ-तरंगदैर्ध्य उत्सर्जन प्रतिदीप्ति का।

  12. प्रतिदीप्ति व इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शिकी के बारे में निम्नलिखित में से कौन-से कथन सही हैं?

    1. प्रतिदीप्तिवर्णक उत्तेजक प्रकाश से दीर्घ तरंगदैर्ध्य का प्रकाश उत्सर्जित करता है
    2. TEM प्रतिबिंब भारी धातुओं से अभिरंजित अति-पतले काटों से गुज़रते इलेक्ट्रॉनों से बनते हैं
    3. SEM कोशिका की आंतरिक संरचनाएँ TEM से बेहतर विभेदित करता है
    4. विषाणुओं के ऋणात्मक अभिरंजन में कण हल्की पृष्ठभूमि पर गहरे दिखते हैं
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — प्रतिदीप्तिवर्णक उत्तेजक प्रकाश से दीर्घ तरंगदैर्ध्य का प्रकाश उत्सर्जित करता है; B — TEM प्रतिबिंब भारी धातुओं से अभिरंजित अति-पतले काटों से गुज़रते इलेक्ट्रॉनों से बनते हैं

    अवशोषित ऊर्जा का एक भाग उत्सर्जन से पहले खो जाता है, अतः प्रतिदीप्ति दीर्घ तरंगदैर्ध्य की ओर खिसकी होती है (स्टोक्स विस्थापन); TEM पारगमित इलेक्ट्रॉन और विपर्यास हेतु भारी-धातु अभिरंजक प्रयोग करता है। SEM द्वितीयक इलेक्ट्रॉनों से सतहों का प्रतिबिंब बनाता है और उसका विभेदन TEM से स्थूल है। ऋणात्मक अभिरंजक पृष्ठभूमि भरता है और कण की रूपरेखा बनाता है, अतः कण गहरे क्षेत्र पर हल्का दिखता है।

  13. रोगी के सीरम में डेंगू प्रतिजन को पट्टिका पर लेपित एक प्रतिरक्षी पकड़ता है और फिर उसी प्रतिजन के भिन्न एपिटोप के विरुद्ध एंज़ाइम-संबद्ध प्रतिरक्षी से उसका संसूचन होता है। यह प्रारूप है

    1. अप्रत्यक्ष ELISA
    2. सैंडविच ELISA
    3. प्रतिस्पर्धी ELISA
    4. प्रत्यक्ष प्रतिरक्षा-प्रतिदीप्ति
    उत्तर देखें

    उत्तर: B — सैंडविच ELISA

    प्रतिजन दो भिन्न एपिटोपों के विरुद्ध एक पकड़ने वाले व एक संसूचक प्रतिरक्षी के बीच फँसा है, जो प्रतिजन संसूचन की मानक अभिकल्पना है। अप्रत्यक्ष ELISA, जो लुभावना विकल्प है, पट्टिका पर प्रतिजन लेपित करता है और रोगी का प्रतिरक्षी अंकित प्रति-मानव इम्युनोग्लोबुलिन से पकड़ता है। प्रतिस्पर्धी ELISA में विश्लेष्य बढ़ने पर संकेत घटता है, और प्रतिरक्षा-प्रतिदीप्ति कोशिकाओं पर प्रतिदीप्तिवर्णक प्रयोग करती है, कूप में एंज़ाइम नहीं।

  14. एक नली समूहन परीक्षण में रोगी के सीरम की 1:10 से 1:1280 तक दोगुनी तनुताएँ मृत जीवाणु निलंबन से मिलाई जाती हैं। 1:10 से 1:40 पर गुच्छन नहीं, 1:80 से 1:640 पर गुच्छन और 1:1280 पर गुच्छन नहीं होता। कौन-सी व्याख्या सही है?

    1. सीरम में कोई विशिष्ट प्रतिरक्षी नहीं है, और बीच की नलियों का गुच्छन अविशिष्ट है
    2. अनुमापांक 1280 है, क्योंकि अंतिम नली प्रतिरक्षी सक्रियता का अंत-बिंदु दर्शाती है
    3. प्रतिरक्षी-आधिक्य का प्रोज़ोन निम्न तनुताओं को ढक लेता है, और अनुमापांक 640 है
    4. निम्न तनुताओं में प्रतिजन-आधिक्य गुच्छन रोकता है, और अनुमापांक 80 है
    उत्तर देखें

    उत्तर: C — प्रतिरक्षी-आधिक्य का प्रोज़ोन निम्न तनुताओं को ढक लेता है, और अनुमापांक 640 है

    सांद्र सीरम में प्रतिरक्षी हर जीवाणु को अलग-अलग संतृप्त करता है, अतः पार-बंधित जालक नहीं बनता: यही प्रोज़ोन है। अनुमापांक उस उच्चतम तनुता का व्युत्क्रम है जो अब भी समूहन दिखाए, यानी 640। 1:1280 नली ऋणात्मक है, अतः 1280 अनुमापांक नहीं है; प्रतिजन की मात्रा हर नली में समान है, अतः प्रतिजन-आधिक्य केवल निम्न तनुता पर विफलता नहीं समझा सकता, और 1:640 के बाद तनुकरण पर लुप्त होने वाली अभिक्रिया विशिष्ट है।

  15. किसी रोगजनक जीन हेतु रियल-टाइम PCR मानक वक्र Ct = 37.5 − 3.32 log₁₀N₀ पढ़ता है, जहाँ N₀ अभिक्रिया में लक्ष्य प्रतिलिपियों की संख्या है। स्वैब परिवहन माध्यम के 0.5 mL से DNA 50 µL में निष्कर्षित किया जाता है, और इस निष्कर्ष के 2 µL एक अभिक्रिया में प्रयुक्त होते हैं जो Ct = 27.54 देती है। पूर्ण निष्कर्षण मानते हुए, परिवहन माध्यम के प्रति mL लक्ष्य प्रतिलिपियों की संख्या, 10⁴ की इकाइयों में, ____ है।

    संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।

    उत्तर देखें

    उत्तर: 5

    log₁₀N₀ = (37.5 − 27.54)/3.32 = 9.96/3.32 = 3.00, अतः अभिक्रिया में 10³ प्रतिलिपियाँ थीं। अभिक्रिया ने 50 में से 2 µL प्रयोग किए, अतः निष्कर्ष में 10³ × 25 = 2.5 × 10⁴ प्रतिलिपियाँ थीं, सभी 0.5 mL माध्यम से: 2.5 × 10⁴ ÷ 0.5 = 5 × 10⁴ प्रतिलिपियाँ प्रति mL। प्रति अभिक्रिया प्रतिलिपियों पर रुक जाना (इन इकाइयों में 0.1) या 0.5 mL भूल जाना (2.5) सामान्य भूलें हैं।

  16. TaqMan जल-अपघटन-प्रोब परख को प्राइमर-द्वितयों हेतु गलन-वक्र जाँच की आवश्यकता क्यों नहीं होती, जबकि SYBR Green परख को होती है?

    1. SYBR Green केवल एकलरज्जुकी DNA के साथ प्रतिदीप्त होता है, अतः प्रवर्धित उत्पाद अविश्वसनीय ढंग से बताता है
    2. TaqMan रिपोर्टर तब भी प्रतिदीप्त होता है जब अभिक्रिया-नली में कोई भी द्विरज्जुकी DNA उपस्थित हो
    3. TaqMan प्रोबों के साथ प्रयुक्त पॉलिमरेज़ प्रूफ़रीडिंग करता है और इसलिए प्राइमर-द्वितय बनते ही नष्ट कर देता है
    4. रिपोर्टर तभी मुक्त होता है जब पॉलिमरेज़ लक्ष्य अनुक्रम से संकरित प्रोब को काटता है
    उत्तर देखें

    उत्तर: D — रिपोर्टर तभी मुक्त होता है जब पॉलिमरेज़ लक्ष्य अनुक्रम से संकरित प्रोब को काटता है

    TaqMan परख में प्रतिदीप्ति हेतु प्रोब का विशिष्ट लक्ष्य से संकरण और पॉलिमरेज़ की 5′→3′ एक्सोन्यूक्लिएज़ सक्रियता द्वारा उसका विदलन आवश्यक है, जो रिपोर्टर को क्वेंचर से अलग करता है; प्राइमर-द्वितयों में प्रोब-स्थल नहीं होता और वे संकेत नहीं देते। SYBR Green द्वितयों सहित किसी भी द्विरज्जुकी DNA से बंधता है, इसलिए गलन-वक्र चाहिए। Taq में प्रूफ़रीडिंग नहीं है, और किसी भी dsDNA को बताने वाला प्रोब SYBR Green का वर्णन होगा, TaqMan का नहीं।

  17. एक जीवाणु में ऐसा CRISPR स्पेसर है जो फ़ेज P के एक अनुक्रम से ठीक मेल खाता है। उस स्पेसर से अनुलेखित crRNA Cas9 को जीवाणु की अपनी CRISPR शृंखला, जिसमें वही अनुक्रम है, काटने हेतु निर्देशित क्यों नहीं करता?

    1. शृंखला में अनुक्रम के पास पुनरावृत्तियाँ हैं, वह PAM नहीं जो Cas9 को अपने लक्ष्य के पास चाहिए
    2. शृंखला हर एडेनीन पर मेथिलीकृत है, और मेथिलीकरण Cas9 को परपोषी DNA से बंधने से रोकता है
    3. crRNA केवल RNA से युग्मित होता है, अतः Cas9 फ़ेज अनुलेखों तक जाता है, DNA तक कभी नहीं
    4. Cas9 केवल फ़ेज संक्रमण के बाद बनता है और शृंखला की अगली प्रतिकृति से पहले अपघटित हो जाता है
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — शृंखला में अनुक्रम के पास पुनरावृत्तियाँ हैं, वह PAM नहीं जो Cas9 को अपने लक्ष्य के पास चाहिए

    Cas9 केवल वही प्रोटोस्पेसर काटता है जो अपने PAM के पास हो (Streptococcus pyogenes एंज़ाइम हेतु 5′-NGG-3′)। शृंखला के स्पेसरों के पास पुनरावृत्तियाँ होती हैं, जिनमें PAM नहीं होता, अतः स्व-लक्ष्यीकरण टल जाता है। मेथिलीकरण वह तरीका है जिससे प्रतिबंधन–रूपांतरण तंत्र परपोषी DNA बचाते हैं, जो लुभावनी उपमा है, पर CRISPR इस प्रकार भेद नहीं करता; Cas9 DNA को लक्ष्य करता है, और cas जीन प्रायः संक्रमण से पहले भी व्यक्त होते हैं।

  18. CRISPR-Cas तंत्रों के बारे में निम्नलिखित में से कौन-से कथन सही हैं?

    1. नए स्पेसर Cas1–Cas2 संकुल द्वारा आक्रामक DNA से पकड़े जाते हैं और शृंखला के लीडर-सिरे पर जोड़े जाते हैं
    2. Cas9 DNA के दोनों रज्जुक काटकर चार-न्यूक्लियोटाइड 5′ उभार वाले असम सिरे छोड़ता है
    3. Cas13 RNA को लक्ष्य करता है, और रिपोर्टर RNA का उसका संपार्श्विक विदलन निदान में प्रयुक्त होता है
    4. संपादन हेतु प्रयुक्त एकल-मार्गदर्शी RNA crRNA व tracrRNA को एक अणु में संलयित करता है
    उत्तर देखें

    उत्तर: A — नए स्पेसर Cas1–Cas2 संकुल द्वारा आक्रामक DNA से पकड़े जाते हैं और शृंखला के लीडर-सिरे पर जोड़े जाते हैं; C — Cas13 RNA को लक्ष्य करता है, और रिपोर्टर RNA का उसका संपार्श्विक विदलन निदान में प्रयुक्त होता है; D — संपादन हेतु प्रयुक्त एकल-मार्गदर्शी RNA crRNA व tracrRNA को एक अणु में संलयित करता है

    Cas1–Cas2 द्वारा अनुकूलन लीडर-सिरे पर स्पेसर जोड़ता है, Cas13 SHERLOCK के पीछे का RNA-लक्ष्यी प्रभावक है, और sgRNA crRNA व tracrRNA को जोड़ता है। Cas9 के HNH व RuvC डोमेन एक ही स्थान पर एक-एक रज्जुक काटते हैं, जिससे कुंद सिरा बनता है; असम काट Cas12a बनाता है।